Mikroskopische Verfahren

3.11.1. Selektion von transgenen Wurzeln

Drei bis sechs Wochen nach der Transformation (3.9.3) wurden Wurzeln von M. truncatula auf Expression der eingebrachten Konstrukte überprüft. Für die Untersuchungen wurde ein MZFLIII-Fluoreszenzbinokular der Firma Leica verwendet. Dieses ist mit einer Kaltlichtquelle, einem 100 W HBO-Brenner, zwei verschiedenen Objektiven (Plano 1 x NA 0,125 und PlanApo 1,6 x NA 0,125) und Filtern für GFP-, CFP-, YFP- und dsRed-Anregung ausgestattet:

Filterset Anregungsfilter Sperrfilter GFP Plant flourescence 470/40 nm 525/50 nm

CFP 436/20 nm 480/40 nm

YFP 510/20 nm 560/40 nm

DsRed 546/12 nm 560 LP

Tab. 3.6. Filterausstattung des Leica MZFLIII Fluoreszenzbinokulars. LP = long pass Filter

Mit dem Leica MZFLIII Fluoreszenzbinokular lassen sich transformierte Pflanzen nicht invasiv überprüfen. Wie unter Punkt (3.9.3.) beschrieben, werden die Pflanzen in auf Nährmedium in Petrischalen kultiviert. Diese müssen zur Untersuchung nicht geöffnet werden, so daß die das Material weiterhin steril bleibt. Transgene Wurzeln können von nicht transgenen Wurzeln an der deutlich sichtbaren grünen GFP-Fluoreszenz unterschieden werden. Nicht transgene Wurzeln zeigen vorwiegend gelbe Autofluoreszenz und, in Abhängigkeit von den zur Kultivierung eingesetzten Lichtbedingungen, teilweise rote Autofluoreszenz der Proplastiden.

3.11.2. Zwei-Photonen Mikroskopie

In der „normalen“ Fluoreszenzmikroskopie werden Moleküle durch die Absorption von einzelnen Lichtquanten in einen energiereichen, angeregten Zustand versetzt. Ein Teil der Anregungsenergie wird als Fluoreszenz wieder emittiert, wenn das Molekül in den energieärmeren Grundzustand zurückfällt (Abb. 3.5.). Die absorbierte Energie berechnet sich dabei wie folgt:

∆E = Ee – Eg = hνabs

wobei:

∆E = Energiedifferenz e = angeregter Zustand g = Grundzustand

νabs = Frequenz entsprechend der Bohrschen Frequenzbedingung h = Plancksches Wirkungsquantum

Abb. 3.5.: Vergleich der Energieschemata von Fluoreszenz- und Zwei-Photonen-Anregung. Links: Bei der konventionellen Fluoreszenzanregung wird ein energiereiches Lichtquant absorbiert. Dadurch erreicht das Molekül einen energiereicheren, angeregten Zustand (S*). Innerhalb von 10^-10 bis 10^-7 Sekunden gibt das angeregte Molekül einen Teil der absorbierten Energie als Wärmestrahlung, den Rest hingegen als Fluoreszenzstrahlung ab und fällt in den nicht angeregten Grundzustand zurück (S). Rechts: Bei der Zwei-Photonen Mikroskopie wird die notwendige Energie zur Anregung des Moleküls durch Absorption von zwei Lichtquanten geliefert. Das Prinzip funktioniert nur, wenn die beiden Quanten praktisch gleichzeitig von dem Molekül absorbiert werden, so daß es einen kritischen Übergangszustand (K) überwinden kann. Genau wie bei der konventionellen Fluoreszenzanregung wird ein Teil der aufgenommenen Energie als Wärme abgestrahlt, der andere Teil hingegen als Fluoreszenz emittiert.

Nach den Regeln der Quantenmechanik ist es allerdings möglich, die zur Fluoreszenz notwendige Anregungsenergie auch durch die Absorption mehrerer Lichtquanten geringen Energiegehalts zu erreichen, insofern diese gleichzeitig absorbiert werden (Abb. 3.5.). Dieses Prinzip wurde schon Anfang des letzten Jahrhunderts erkannt und von der späteren Nobelpreisträgerin Maria Göppert-Mayer theoretisch formuliert (Göppert-Göppert-Mayer, 1929).

Ein ganz wesentlicher Unterschied zwischen der Ein- und Zwei-Photonen Technik besteht in der Fokusabhängigkeit der Zwei-Photonen Anregung. Bei der Ein-Photonen Anregung, wie sie beim confokalen Laserscanningmikroskop verwendet wird, kann die Absorption von Photonen entlang der gesamten Strahlachse erfolgen:

wobei:

Nabs (z) = Anzahl der pro Puls absorbierten Photonen in der Tiefe z σ = Wirkungsquerschnitt

E0 = Gesamtenergie im Puls hν = Frequenz des Laserlichts dz = Schichtdicke

nF = Volumendichte

1P = Ein-Photonen Anregung

Die Absorption von Photonen ist also unabhängig von der Tiefe z, und es können auch Moleküle außerhalb der Fokusebene angeregt werden. Dieses wiederum zieht Streulichteffekte nach sich, die durch die Verwendung einer Lochblende (Pinhole) minimiert werden müssen. Bei der Zwei-Photonen Anregung hingegen erfolgt die Zwei-Photonen Anregung ausschließlich im Fokus, weil nur hier die Intensität der auftreffenden Strahlen hoch genug ist:

wobei

Nabs (z) = Anzahl der pro Puls absorbierten Photonen in der Tiefe z σ = Wirkungsquerschnitt

E0 = Gesamtenergie im Puls hν = Frequenz des Laserlichts τ = volle zeitliche Halbwertsbreite πω² = Strahlquerschnitt

dz = Schichtdicke nF = Volumendichte

2P = Zwei-Photonen Anregung

Das insgesamt angeregte Volumen ist daher bei der Zwei-Photonen Mikroskopie wesentlich kleiner als bei der Ein-Photonen Mikroskopie und es entfällt die Notwendigkeit der Verwendung einer

Lochblende, weil kein Streulicht aus anderen Ebenen einfällt (Piston, 1999). Zugleich ergibt sich daraus der Vorteil, daß es nicht zum Ausbleichen der Probe außerhalb der Fokusebene kommt.

Das erste Zwei-Photonen Laser Raster Mikroskop wurde 1990 von Winfried Denk, James Strickler und Watt Webb (Cornell University, USA) vorgestellt und patentiert (Denk et al., 1990). Bei der Methode wird das zu untersuchende Präparat mit ultrakurzen Laserpulsen aus einem Titan-Saphir (Ti:Sa) Laser bestrahlt. Die Pulslänge liegt dabei typischerweise in einem Bereich von 50 bis 100 Femtosekunden bei einem Pulsabstand von 12,5 ns. Die meisten heute erhältlichen Ti:Sa Laser arbeiten dabei in einem Wellenlängenbereich zwischen 720 nm und 900 nm. Die Verwendung eines Infrarot-Lasers hat den positiven Nebeneffekt, daß sich die phototoxische Wirkung auf das Präparat verringert. Im Vergleich zur Ein-Photonen Mikroskopie treten geringere Strahlenschädigungen pro Zeiteinheit auf, wodurch sich das Ausbleichen der Probe verzögert. Mit der Zwei-Photonen Anregung verlängert sich also der Untersuchungszeitraum für die Probe (Squire & Bastiaens, 1999).

In dieser Arbeit wurde ein Aufbau zur Zwei-Photonen Mikroskopie in der Fakultät für Physik verwendet. Die Funktionsweise des Mikroskops ist schematisch in Abb. 3.6. wiedergegeben:

Abb. 3.6.: Schematische Zeichnung des Zwei-Photonen Mikroskops. Der Infrarot-Laserstrahl wird von einem Titan-Saphir-Laser erzeugt und über Umlenkspiegel zu einem xy-Scanner geleitet. Hier wird der Laserstrahl durch einen Strahlteiler in 64 Einzelstrahlen aufgeteilt und die Positionierung in xy-Richtung moduliert. Die Strahlen werden dann weiter zum Mikroskop und über das Wasserimmersionsobjektiv zum Präparat geleitet. Im Fokus des Objektivs kommt es zur Zwei-Photonen Anregung und es entsteht Fluoreszenz, die unter anderem zum Objektiv zurückgestrahlt wird. Das Fluoreszenzlicht gelangt über die Objektivöffnung zu einem dichroischen Spiegel und wird dort zur Kamera umgelenkt. Die Kamera wird über eine Steuerungssoftware auf dem Computer kontrolliert.

Erfaßte Daten werden auf dem Computer gespeichert und können dort nachbearbeitet werden.

Das System bestand aus einem Olympus IX-70 Inversmikroskop, einem Strahlteiler für multifokale Multiphoton-Mikroskopie und einem MaiTai Infrarot Laser (Nielsen et al., 2001). Das Mikroskop war mit einem Infrarot-korregierten Olympus 40 x LUMPLanFI / IR Wasserimmersionsobjektiv (NA = 0,8) ausgestattet. Zur Zwei-Photonen Anregung wurde ein gepulster Laserstrahl von 860 nm verwendet.

Bilder wurden von einer Andor DV887 Kamera, kontrolliert durch die zugehörige iXon Steuerungssoftware (Vers. 1.1.45.0) aufgenommen und auf einem Computer gespeichert. Auf dem Weg zur Kamera war ein GFP-Filter in den Lichtweg geschoben, um emittiertes Licht zu filtern.

Einzelbilder wurden in einem Abstand von je 1 sec aufgenommen, im *.tif-file Format exportiert und

mittels der Hyugens Essential (Scientific Volume Imaging b.v., Alexanderlaan 14, 1213 XS Hilversum, Netherlands) Dekonvolutionssoftware nachbearbeitet (siehe 3.12.1).

3.11.3. Confokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM)

Die confokale Lasermikroskopie erfolgt nach dem Prinzip der Ein-Photonen Anregung, wie sie in Abbildung 3.5. skizziert ist und verlangt daher nach dem Einsatz einer Lochblende, um den Einfall Streulicht aus nichtfokussierten Ebenen zu minimieren.

In dieser Arbeit wurde ein Leica DMRE (SDK) Mikroskop, ausgestattet mit einem TCS-SP2 confokalen Scankopf, verwendet (Leica Microsystems, Heidelberg). Zur Datenerfassung wurde das Mikroskop von der Leica LCS (Vers. 2.00.871) Software gesteuert. Transgene Wurzeln wurden jeweils mit einem Leica 63 x HCX PlAPO Ölimmersionsobjektiv (NA = 1.32) mikroskopiert. Für die Untersuchung der GFP-Fluoreszenz wurde bei 488 nm angeregt und die Emission zwischen 500 nm und 600 nm erfaßt.

Zur Doppellokalisierung von GFP und MitoTracker^® Red CMXRos oder FM^®4-64 wurde das GFP bei 488 nm angeregt und die Emission zwischen 500 nm und 540 nm gemessen. Die Farbstoffe hingegen wurden bei 543 nm angeregt und die Emission zwischen 580 nm und 670 nm dokumentiert. Für die Aufnahmen wurden generell folgende Einstellungen gewählt:

• Modus xyt

• Beam expand 3

• Format 1024x1024 Pixel

• Line Average 4

• Pinhole Airy 1

• Scangeschwindigkeit 400 Hz

Einzelbilder wurden in einem Abstand von ca. 12 Sekunden aufgenommen und mittels der Leica LCS Software als avi-Videofiles mit einer Bildwiederholungsrate von 15 pro Sekunde exportiert.