Mikrokatheterisierung des linken Ventrikels

Die Mikrokatheterisierung des linken Herzventrikels erfolgte bei den Versuchstieren der Kontrollgruppe nach 0 h und bei den Traumagruppen, Traumagruppen plus Nikotinapplikation und Scheinkontrollgruppen 12 h oder 24 h nach der experimentellen

N. vagus und V. jugularis meist schon für einen kleinen Abschnitt sichtbar. Eine verbesserte Sicht konnte durch Wegdrängen des longitudinal verlaufenden Muskelstranges nach medial erreicht werden. Anschließend konnte mit der Hilfe der gebogenen spitzen Pinzette die A. carotis mit N. vagus und V. jugularis aufgeladen werden.

Die isolierte und von Bindegewebe befreite A. carotis wurde dann auf eine von der linken Körperhälfte aus untergeschobene schmale anatomische Pinzette abgelegt. Durch das Loslassen der Pinzette wurde die A. carotis in einem Verlauf von ungefähr 1,5 cm gut sichtbar und zugänglich. Nun wurde der proximale Anteil der Arterie kaudal der kaudalen Pinzettenspange mit einem Biemer-Clip abgeklemmt. Der distale Anteil der Arterie wurde kranial der kranialen Pinzettenspange mit einem elastischen Bindfaden abgebunden, um einen Blutverlust aus diesem Anteil nach dem Einschneiden der Arterie zu verhindern. Ein zweiter elastischer Bindfaden wurde im kaudalen Drittel zwischen den Pinzettenspangen locker einmal um die Arterie gelegt.

Mit Hilfe der mikrochirurgischen Schere wurde die Arterie danach im kranialen Drittel zwischen den Pinzettenspangen um ungefähr die Hälfte des Gefäßdurchmessers eingeschnitten. Das Einschnittloch wurde daraufhin mit der gebogenen spitzen Pinzette etwas aufgeweitet. Jene Pinzette als Leitschiene nutzend konnte der Mikro-Tip Katheter bis zur kaudalen Pinzettenspange in die Arterie eingeführt werden. Anschließend wurden die schmale anatomische Pinzette und der Biemer-Clip entfernt. Damit konnte der Katheter bis zum linken Ventrikel vorgeschoben werden. Die richtige Lage wurde anhand der charakteristischen Druckkurve des linken Ventrikels (Abb. 3-4) überprüft, woraufhin der Katheter mit beiden Biemer-Clips fixiert wurde.

und an den Aa. pulmonales abgetrennt. Das aus dem Körper gelöste Herz wurde dann mit gekühlter PBS-Lösung durchgespült. Der linke Ventrikel wurde isoliert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die folgenden Organproben wurden ebenfalls mit gekühlter PBS-Lösung gesäubert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Nach der Herzpräparation wurde mit der Präparierschere ein ungefähr 1 cm x 2 cm großes Präparat aus dem linken Leberlappen geschnitten.

Für die Milzentnahme wurden die Gefäße und Ligamenta der Milz durchtrennt. Durch zwei Schnitte wurde das Hilum der Milz sorgfältig entfernt und letzte sichtbare Reste des Bindegewebes beseitigt.

Darauf folgend wurde die linke Niere präpariert. Zunächst wurde sie aus ihrer Fettkapsel gelöst. Dann wurden die Hilusgefäße, das Nierenbecken und die fibröse Nierenkapsel entfernt.

Als letztes Organ wurde die Lunge präpariert. Durch die Entfernung des Herzens gut überschaubar konnte das Parenchym beider Lungenflügel geborgen werden. Anschließend wurden die Anteile des Gefäß- und Bronchialsystems sorgfältig entfernt.

Das entnommene Blut wurde bei 4 °C und 1000-facher Erdschwerebeschleunigung für 20 Minuten zentrifugiert. Daraufhin wurde das Serum abpipettiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

3.9 Organhomogenisate

Jedes entnommene Organ wurde homogenisiert. Die in dem jeweiligen Arbeitsabschnitt zu homogenisierenden Organe wurden in ihren Kryo-Röhrchen in flüssigem Stickstoff gelagert.

Weiter vorbereitend musste zunächst der RIPA-Puffer in im Anhang genannter Zusammensetzung hergestellt werden. Zu jeweils 50 ml Puffer wurde dann je eine Tablette Complete^® (Protease-Inibitor-Mix) hinzugefügt. Daraufhin kam in jedes Eppendorf-Reaktionsgefäß 1 ml des RIPA-Puffer-Complete-Gemisches und 100 mg des jeweiligen homogenisierten Organs. Zur Homogenisierung wurden die Organe in Stickstoff gemörsert und mit einem Homogenisator zerkleinert. Das Gemisch wurde sorgfältig durchmischt und anschließend bei 3000-facher Erdschwerebeschleunigung und 4 °C für 5 Minuten zentrifugiert. Abschließend wurde der Überstand in ein neues Kryo-Röhrchen pipettiert und schockgefroren. Die Organ-Homogenisate lagerten bei -80 °C.

3 Material und Methoden 22

3.10 ELISA

3.10.1 TNF-α-, IL-1β- und IL-6-ELISA

Zu Beginn stand die Vorbereitung der ELISA-Platte (Coating). Dazu wurden jeweils 100 µl des Capture-Antikörpers in jedes Well pipettiert. Die Platte wurde über Nacht in Dunkelheit zur Inkubation belassen. Am nächsten Tag wurde die Platte gewaschen. Ein Waschgang umfasste ein dreimaliges Auswaschen jedes Wells mit Waschpuffer aus einer Spritzflasche.

Abschließend wurde der Waschpuffer durch Aufschlagen auf gut resorbierendes Papier augenscheinlich vollständig entfernt.

Nach dem Waschen wurde die Platte geblockt. Dazu wurde in jedes Well 300 µl Reagent Diluent gegeben. Darauf folgte eine Inkubationszeit von einer Stunde. Mit einem abschließenden Waschgang war die Platte fertig für die Auftragung der Proben.

Anschließend wurden der Standard und die Proben aufgetragen. Dies erfolgte jeweils als Duplikat. Die Standardreihe wurde direkt aufgetragen, die Organhomogenisate wurden vorher mit Reagent Diluent verdünnt. Die Leber- und Milz-Homogenisate wurden im Verhältnis 1:100, die Nieren-, Lungen- und Herz-Homogenisate wurden im Verhältnis 1:10 verdünnt.

Von den verdünnten Organhomogenisaten wurden jeweils 100 µl in die entsprechenden Wells pipettiert.

Nach einer Inkubationszeit von zwei Stunden wurde die Platte gewaschen. Dann wurden jeweils 100 µl Detection-Antikörper in der jeweiligen Arbeitskonzentration in die Wells pipettiert. Es folgten weitere zwei Stunden Inkubationszeit und ein Waschgang, wonach in jedes Well 100 µl Streptavidin-HRP in Arbeitskonzentration pipettiert wurde. Anschließend wurde die Platte 20 Minuten in Dunkelheit zur Inkubation belassen. Es folgte ein weiterer Waschgang, woraufhin 100 µl Substrate Solution in jedes Well pipettiert wurde. Die Platte wurde dann für 20 Minuten in Dunkelheit zur Inkubation belassen. Nach der letzten Inkubation wurde in jedes Well 50 µl Stop Solution pipettiert.

Abschließend erfolgte die Messung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 450 nm.

Die Auswertung wurde durch Analyse eines Plattenlesegerätes der Fa. Tecan und der Software Magellan durchgeführt.

3.10.2 Cotinin-ELISA

Cotinin ist ein Abbauprodukt von Nikotin. Die Messung der Cotininkonzentration im Serum sollte die Nikotinaufnahme durch das aufgebrachte Nikotinpflaster veranschaulichen. Der dazu verwendete ELISA wurde vom Hersteller so vorbereitet, dass das direkte Auftragen der Proben möglich war.

Diese wurden genauso wie die Standardreihe folglich im ersten Schritt pipettiert, jeweils als Duplikat. Anschließend wurde 100 µl Enzym Konjugat in jedes Well pipettiert und die Platte in Dunkelheit für 60 Minuten belassen. Darauf folgten ein Waschgang, der mit einer Spritzflasche durchgeführt wurde und ein sechsmaliges Ausspülen der Wells mit destilliertem Wasser umfasste. Die Platte wurde, den Waschgang abschließend, auf resorbierendem Papier ausgeklopft.

Anschließend wurde zu jedem Well 100 µl Substrate Reagent hinzu gegeben und die Platte abgedunkelt für 30 Minuten zur Inkubation belassen. Daraufhin wurde in jedes Well 100 µl Stop Solution pipettiert.

Abschließend erfolgte die Messung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 450 nm.

Die Auswertung wurde durch Analyse eines Plattenlesegerätes der Fa. Tecan und der Software Magellan durchgeführt.