Die Mikroinjektion ist eine der effizientesten Methoden, um Makromoleküle in Zellen einzuführen. Die Mikroinjektion in adhärent wachsende Zellkulturzellen mit Kapillaren wurde von Graessmann [Graessmann et al. 1980] entwickelt. Die Methode macht es möglich, einzelne Zellen als Studienobjekt für komplexe zelluläre Vorgänge, Strukturen und Funktionen in vivo zu nutzen. Eine Reihe von Molekülen wie Proteine, Nukleinsäuren und Farbstoffe können injiziert werden.
Die Injektionslösung kann dabei direkt in Kern oder Cytoplasma appliziert werden. Für die Mikroinjektion werden feine Kapillaren verwendet, mit einem Spitzendurchmesser von unter 1 µm. Der Experimentator verfolgt den Injektionsvorgang an einem Mikroskop. Zur Injektion wird die zu injizierende Zelle von der Kapillarspitze penetriert. Die Probenlösung wird durch einen an der Kapillare angelegten Druck in die Zelle abgegeben. Normalerweise beträgt das Injektionsvolumen bei Cytoplasma-Injektionen 0,05 pl und bei Kern-Injektionen 0.02 pl, was etwa 5 bis 10 % des Zellvolumens gleichkommt. Das entspricht ungefähr einer Verdünnung der Probenkonzentration durch die Injektion um den Faktor 10 bis 20.
Die Limitation der Methode ist die Anzahl an Zellen, in die in einer bestimmten Zeit Probe injiziert werden kann.
5.1 Kultivierung und Handhabung der Zellen für die Mikroinjektionsexperimente
Alle Mikroinjektionsexperimente wurden an Vero-Zellen (ATCC CCL 81) durchgeführt. Es handelt sich dabei um eine adhärent wachsende Zelllinie, die aus der Niere einer gesunden gelbgrünen afrikanischen Meerkatze (Cercopithecus sabaeus) etabliert wurde (Yasumura, 1963).
Die in dieser Arbeit verwendeten Vero-Zellen wurden von Herrn Dr. R. Pepperkok (ICRF, London, Großbritannien) bezogen.
Die Vero-Zellen wurden als Monolayer-Zellen in 25 cm2-Gewebekulturflaschen in Minimal Essential Medium (MEM), 5 % fetalem Kälberserum und Kanamycin (100 UG/ml) im Brutschrank bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und einem CO2-Gehalt von 5 % kultiviert.
Die Vero-Zellen wurden zweimal in der Woche passagiert. Die Passagierung lief wie folgt ab:
• Absaugen des Kulturmediums
• Inkubation der Zellen in 5 ml Trypsinlösung (0,06 % Trypsin, 0,02 % EDTA in PBS) für 2,5 Minuten bei 37 °C im Brutschrank
• Absaugen der Trypsinlösung
• Resuspension der nur noch locker an der Kulturschale anhaftenden Zellen in 10 ml Kulturmedium
• Entnahme eines Aliquots der Zellsuspension zur Zellzahlbestimmung in einer Neubauer-Zählkammer
• Überführen von 2*105 bis 5*105 Zellen in neue Kulturflaschen
PBS: 137 mM Natriumchlorid
2,68 mM Kaliumchlorid
80,1 mM Dinatriumhydrogencarbonat
1,47 mM Kaliumdihydrogencarbonat
Um eine konstante Qualität des Zellmaterials zu gewährleisten, wurde alle vier bis sechs Wochen ein frisches Aliquot der in flüssigem Stickstoff gelagerten Zellen aufgetaut.
Für die Mikroinjektion wurden die Zellen auf Deckgläschen aufgezogen. Die Zellen wurden mindestens 24 Stunden zuvor ausplattiert. Die Kultivierung fand in 58 cm2-Schalen (Falcon, beschichtet) mit bis zu 20 Glasdeckgläschen (rund, Durchmesser von 10 mm) statt. Eine 70
% ige Konfluenz der Zellen wurde angestrebt. Dazu wurden 1,5*106 Zellen pro Schale angesetzt. Nach 24 Stunden war mit einer Zelldichte von 3*106 Zellen pro Schale zu rechnen.
Für die Mikroinjektion wurden die Deckgläschen in eine Petrischale transferiert, die Carbonat-freies Medium beinhaltete, da der CO2-Gehalt der Umgebungsluft zu niedrig ist, um den gewünschten pH-Wert zu halten. Aus diesem Grund wurde HEPES-gepuffertes Medium verwendet.
Vorbereitung der Deckgläschen
Die Deckgläschen wurden mit Aceton und dest. Wasser gereinigt, um eventuelle Verunreinigungen zu entfernen. Nach dem Trocknen wurde mit einem Diamantschreiber ein Kreuz zentral in die Deckgläschen geritzt, welches als Orientierungshilfe während des experimentellen Ablaufes diente. Die Deckgläschen wurden autoklaviert.
5.2 Kapillaren
Als Injektionskapillaren wurden Fertiglaskapillaren, Femptotips I (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg), verwendet. Sie haben eine Kunststoffassung zum Einschrauben in den Eppendorf-Kapillarhalter. Ihr Innendurchmesser beträgt 0,5 µm, ihr Außendurchmesser 1 µm. Sie zeichnen sich durch die hohe Reproduzierbarkeit ihrer Form und des Öffnungsdurchmessers aus.
Außerdem wurden selbst ausgezogene Glaskapillaren benutzt. Die verwendeten Rohkapillaren waren aus Borsilikatglas (GC120TF-10, Clark Electromedical Instruments, UK). Diese Kapillaren haben einen äußeren Durchmesser von 1,2 mm, einen Wanddurchmesser von 0,13 mm und ein dünnes Innenfilament (0,1 mm).
Ziehen von Injektionskapillaren
Das Ausziehen der Rohkapillaren wurde mit Hilfe eines Sutter Instruments Puller (Modell P-87, USA) durchgeführt. Die Rohkapillaren werden in den Puller eingespannt, in dem sie an den Enden arretiert werden. Die Mitte der Rohkapillare ist von einem Heizfilament umgeben, durch das die Kapillare lokal angeschmolzen werden kann. Nach 10 bis 15 Sekunden werden die Kapillarenenden ruckartig auseinander gezogen, wodurch sich Form und Öffnung ergeben.
Die Kapillaren werden vorzugsweise kurz vor der Injektion gezogen, da sie direkt nach dem Ausziehen aufgrund der hohen Temperatur steril sind.
• Einspannen der Rohkapillare in die Halterungen des Pullers, wobei das Filament nicht berührt werden darf
• Auswählen eines Programmes (Druck: 370 hPa, Temperatur: 630, Zug: 170, Geschwindigkeit: 100, Zeit: 135)
• Auslösen des Pull-Vorganges
Durch Veränderung der Temperatureinstellung kann der Spitzendurchmesser verändert werden. Es gilt: Je höher die Temperatur, desto kleiner die Öffnung.
5.3 Injektionsproben
Zur Untersuchung der Lokalisation der C-Untereinheit der PKA wurde Cy3-markierte, myristylierte rekombinante Cα-Untereinheit (rCαmyr-Cy3) injiziert. Als Kontrolle für den aktiven Transport wurde mit FLOUS- bzw. Cy3-markiertes BSA-NLS verwendet [Cordes et al. 1997]. Diese fluoreszenzmarkierten BSA-Moleküle, an die mehrere NLS-Peptide gekoppelt waren, wurden von Herrn H.-R. Rackwitz (DKFZ, Heidelberg) und Herrn D. Görlich (ZMBH, Uni Heidelberg) zur Verfügung gestellt. Als Diffusionskontrolle wurde Cy3-gekoppelter Trypsininhibitor aus Sojabohnen (STI-Cy3) (Sigma, Deisenhofen) und Maltose-bindendes Protein (MBP-Cy3) (New England Biolabs, USA) eingesetzt. Kernausschluß wurde durch Injektion von Antikörpern mit Fluoreszenzmarkierung erreicht (Antikörper s.
Material und Methoden 1.3).
Probenvorbereitung
Für eine erfolgreiche Mikroinjektion ist die Probenvorbereitung von großer Bedeutung. Eine Injektion von Probe zu hoher Konzentrationen, von präzipitiertem oder aggregiertem Probenmaterial, toxischen Pufferkomponenten oder Puffer mit ungeeigneten Bedingungen (pH, osmotischer Druck) kann zu einer Schädigung oder Absterben der injizierten Zellen führen.
Die Pufferbedingungen mußten somit an Zellen und Probenmaterial gleichermaßen angepaßt werden. Die Probe und alle Zusätze wurden, wenn möglich, in Mikroinjektionspuffer verdünnt bzw. gelöst.
Die Konzentration der Probe in der Injektionslösung lag in der Regel bei 1 mg/ml, maximal bei 4 mg/ml.
Mikroinjektionspuffer: 2 mM EDTA
10 % (w/v) Glyzerin
1 mM DTT
25 mM Kaliumphosphat, pH 6,8
Der Mikroinjektionspuffer wurde sterilfiltriert (0,2 µm Porendurchmesser). DTT wurde immer frisch zugesetzt.
Um die C-Untereinheit der PKA von den regulatorischen Untereinheiten (R-Untereinheiten) dissoziiert untersuchen zu können, wurde der Injektionsprobe cAMP in einer Konzentration
von 5 mM zugesetzt. Die Konzentrationen aller weiteren coinjizierten Substanzen sind dem Ergebnisteil zu entnehmen.
Befüllen der Injektionskapillaren
Um ein Verstopfen der Kapillare zu vermeiden, wurde die Injektionsprobe zuvor bei 14000 * g für mindestens 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Die Injektionsprobe wurde mit Hilfe eines Microloaders (Eppendorf, Hamburg), einer sehr lang ausgezogenen Pipettenspitze, von hinten in die Kapillare appliziert. Das dünne innere Filament der Kapillare unterstützt den Transport der Probelösung durch die Kapillarkräfte in die Spitze der Kapillare.
Typischerweise werden die Kapillaren mit einem Volumen von 0,2 bis 2 µl befüllt.
Die Kapillare sollte nach dem Beladen zügig in den Kapillarhalter des Mikroinjektors eingespannt und die Spitze in das Injektionsmedium in der Kulturschale auf dem Mikroskoptisch, die die zu injizierenden Zellen enthält, eingetaucht werden, da die Gefahr besteht, daß die Probe in der Kapillarspitze eintrocknet und somit die Kapillare verstopft.
5.4 Mikroinjektion mit dem halbautomatischen System von Eppendorf
Apparatur
Die Mikroinjektion erfolgte mit dem halbautomatischen Eppendorfsystem.
Die Mikroinjektion wurde an einem inversen Mikroskop (Zeiss Axiovert 35) durchgeführt, da nur dieses genug Raum für die Kapillare und den Bewegungsroboter läßt. Es wurde mit Phasenkontrastoptik gearbeitet.
Der Mikromanipulator (Model 5170) steuert die Manipulation der Kapillare in x-, y- und z-Achse, setzt das z-Achsen-Limit als definierte Injektionsebene um und führt die automatisierte axiale Injektionsbewegung aus. Die Auslösung der Injektionsfunktion wird über eine Fußtaste gesteuert.
Der Mikroinjektor (Transjektor 5242) stellt den Druck (Injektionsdruck) bereit, der benötigt wird, damit die Probe von der Kapillare in die Zelle gelangt. Am Mikroinjektor können drei verschiedene Drücke und die Injektionszeit eingestellt werden:
• Kompensationsdruck (zum Schutz der Injektionslösung gegen Vermischung mit dem Medium aufgrund der Kapillarkräfte): 50 - 100 hPa
• Injektionsdruck: 100 - 150 hPa
• Reinigungsdruck (zum Freispülen verstopfter Kapillaren): 5000 - 6000 hPa
• Injektionszeit (Zeitdauer, über die Injektionsdruck gehalten wird): 0,1 - 0,3 Sekunden
Einbringen der Kapillare in das Mikroskopfeld, Setzen der Limits und Mikromanipulation
Da die Kapillarspitze leicht abbricht, z.B., wenn sie gegen den Boden der Kulturschalen gestoßen wird, ist bei Ihrer Handhabung Vorsicht geboten.
Zentrieren der Kapillaren
• Einstellen des Mikromanipulator auf ‚fast’ im dynamischen Modus
• Zentrieren der Kapillare über der Mitte des Deckgläschens per Augenmaß
• Absenken der Kapillare, bis die Kapillarenspitze das Medium berührt
• Einstellen eines Objektivs mit kleiner Vergrößerung (3,6x) und Fokussieren auf die Zellen
• Zentrieren der Kapillarspitze im Sichtfeld und weiteres Absenken der Spitze
• Einstellen eines Objektivs mit hoher Vergrößerung (40x)
• Weiteres Absenken der Kapillare, bis Öffnung der Kapillare sowie Zellen im Fokus sind
Setzen der Limits
• Einstellen des Mikromanipulator auf ‚slow’-Modus
• Fokussieren der Zellen
• Absenken der Kapillarspitze bis diese in derselben Fokusebene wie die Zellen ist
• Festsetzten des unteren z-Limits durch Drücken der ‚limit’-Taste
• Bewegen der Kapillare aus der Fokusebene, so daß die Kapillare frei über die Zellen bewegt werden kann
Mikromanipulation und Injektion
Bei der automatisierten Injektion mit dem Eppendorf-System wird eine axiale Bewegung ausgeführt, um die Zelle zu penetrieren. Diese Bewegung resultiert aus der simultanen Bewegung in der x- und z-Achse des Motors des Manipulators. Wenn die Kapillare das vorgegebene z-Limit erreicht hat, wechselt der Mikromanipulator vom Kompensations- zum Injektionsdruck und hält diesen so lange, wie die Injektionszeit gewählt wurde. Der Druck wechselt dann automatisch wieder zum Kompensationsdruck und die Kapillare wird wieder zum Ausgangspunkt bewegt.
Zur Injektion ist die Kapillare mit dem Joystick des Mikromanipulators über die Zelle zu bringen, in die die Probelösung injiziert werden soll. Bei Kerninjektionen wird die Kapillare direkt über den Kern gefahren. Injektionen in das Cytoplasma werden unmittelbar neben dem Kern ausgeführt, dort wo die Stärke des Cytoplasmas am größten ist.
Der Injektionsvorgang wird über das Fußpedal ausgelöst.
Für die Injektionen gilt: Bei einem gegebenen Durchmesser der Öffnung an der Kapillarspitze nimmt die Auslaßrate linear zu dem angesetzten Druck zu und linear mit steigender Viskosität der Probelösung ab.
Die Anzahl der Injektionen wurde durch einen Zähler erfaßt. Gewöhnlich wurden ca. 50 Injektionen pro Ansatz durchgeführt, was in der Regel einer Injektionszeit von 2 Minuten entsprach.
Bei der Injektion wurde darauf geachtet, daß die injizierten Zellen einen gewissen Abstand zueinander hatten, da Nachbarzellen ohne Fluoreszenzfarbstoff zur Bestimmung der Eigenfluoreszenz, ein Wert der als Hintergrund bei der Auswertung von den Meßwerten subtrahiert wurde, benötigt wurden.
5.5 Inkubation der injizierten Zellen
Die Zellen wurden nach der Mikroinjektion für 1 - 30 Minuten bei 37 °C, 98 % Luftfeuchtigkeit, 5 % CO2 in Kulturmedium im Brutschrank inkubiert. Bei Experimenten, die bei 4 °C ablaufen sollten, wurden die Zellen in Kulturschalen mit HEPES-haltigem Medium bei Raumluft auf Eis inkubiert. Den Inkubationsmedien wurde in der Regel 5 mM 8-Br-cAMP zugesetzt, ein membranpermeables, nicht durch Phosphodiesterase hydrolysierbares cAMP-Analogon, das eine Bindung der C-Untereinheit an die R-Untereinheiten unterbindet. Andere Zusätze wie z.B. Inhibitoren wurden dem Medium in den dem Ergebnisteil zu entnehmenden Konzentrationen zugefügt.
5.6 Konservierung der Präparate
Fixierung mit Paraformaldehyd
Zur Fixierung der Zellen wurden diese für 10 Minuten in einer 3 % igen Paraformaldehyd-Lösung bei RT inkubiert.
PFA-Lösung (3 %): 3 g Paraformaldehyd (PFA)
100 ml PBS (pH, 7,4)
Das Paraformaldehyd wurden in 50 ml Wasser bei 65°C so lange gerührt, bis die Lösung klar wurde, anschließend der pH-Wert mit NaOH auf 7,4 eingestellt und 50 ml 2x PBS zugegeben. Die PFA-Lösung wurde partikelfrei filtriert und aliquotiert bei -20°C gelagert.
Einbetten der Präparate
Die auf einem Deckgläschen gewachsenen Zellen wurden mit 5 µl Mowiol-Lösung auf einem Objektträger eingebettet. Die Präparate konnten so mehrere Wochen lichtgeschützt bei 4 °C gelagert werden.
Mowiol-Lösung: 2,4 g Mowiol 4-88
6 ml Glyzerin
6 ml dest. Wasser
12 ml 0,2 m Tris, pH 8,6
2,5 % (w/v) DABCO
Glycerin, Wasser und Mowiol wurden zusammengegeben und 2 Stunden bei RT geschüttelt.
Nach Zugabe von 12 ml Tris-Puffer wurde die Lösung bei 50 °C für ca. 3 Stunden inkubiert.
Um ein vorzeitiges Ausbleichen der Präparate zu verhindern, wurde das Anti-Photobleeching-Reagenz, DABCO, dazugegeben.
Die fertige Mowiol-Lösung wurde filtriert und bei -20 °C gelagert.
5.7 Detektion und Auswertung
Digitalisierte Bilder der fluoreszenten Zellen wurden mit einem Axioplan Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Oberkochen; Lampe: XBO 75 W, HBO 100 W; Filter BP 365, FT 395, LP 397) ausgestattet mit einer computergesteuerten CCD Kamera (Photometrics Ltd Quantix) aufgenommen. Aufnahme und Auswertung der Bilder erfolgte mit der IPLab Spectrum Software (Version 3.1.2, Signal Analytics Corp.).
Zur Quantifizierung der kompartimentspezifischen Fluoreszenzintensitäten wurde die gesamte Fläche von Kern und Cytoplasma herangezogen (Abb. 7). Die durch Abzug des Hintergrundes (mittlerer Grauwert benachbarter, nicht injizierter Zellen) korrigierten Kern- und Cytoplasma-Fluoreszenzintensitäten wurden für jede Zelle separat ermittelt; aus diesen wurde dann das Kern-Cytoplasma-Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten jeder einzelnen Zelle berechnet (Pepperkok et al., 1993). Anschließend wurde ein Mittelwert aller Kern-Cytoplasma-Verhältnis-Werte der Zellen eines Ansatzes genommen. Die Standardabweichung s des Mittelwertes wurde nach folgender Formel berechnet:
( )
∑ ( )
−−±
= n 1
x
s x i
mit n: Stichprobenumfang, x: Mittelwert und xi: Meßwert
Abbildung 7: Auswahl der Auswertebereiche zur Quantifizierung der kompartimentspezifischen Fluoreszenzintensitäten
Die Quantifizierung wurde über digitale Fluoreszenzmikroskopie mit der IPLab Spectrum Software (Version 3.1.2, Signal Analytics Corp.) durchgeführt.