Mikrobiologische Untersuchung

3.1.1 Quantitative Untersuchung auf Hygieneparameter

Am Untersuchungstag wurden die Fleischstücke nach dem Auftauen (für 12 bis 18 h bei 4 °C

± 0.5 °C) aseptisch aus der Verpackung entnommen und auf einen sterilen Teller gelegt.

Nachfolgend wurden von der Oberfläche jeder Fleischprobe jeweils 4 Gewebestanzen (1-2 mm dick) entnommen. Insgesamt entsprachen die Stanzproben einer Fläche von 20 cm² und einem Gewicht von etwa 10 g. Zur Aufarbeitung wurde das Probematerial in einen sterilen Stomacherbeutel eingewogen, mit 90 ml NaCl-Peptonwasser (0,85% NaCl + 0.1% Pepton) als Verdünnungsflüssigkeit aufgefüllt, für 120 s in einem Stomacher (Seward, London, England) homogenisiert. Weitere Verdünnungsreihen wurden nachfolgend hergestellt.

Neben der quantitativen Untersuchung auf E. coli (§ 64 LFGB 00.00–132/2), wurde die Bestimmung der aeroben Gesamtkeimzahl (§ 64 LFGB L06.00-18), sowie die Quantifizierung von Enterobacteriaceae (§ 64 LFGB L06.00-24) durchgeführt.

Für die Untersuchung auf E. coli und die aerobe Gesamtkeimzahl wurden im Doppelansatz Aliquote von 1 ml des Homogenisats und jeder hergestellten Verdünnungsstufe mittels Plattengussverfahren mit dem Trypton-Galle-Glucoronoid-Medium (TBX-Agar, Oxoid LTD.,

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Hampshire, England), und dem nicht selektiven Standard-I-Agar (St-I-Agar, Merck, KGaA, Darmstadt, Germany), vermischt. Nachfolgend wurden die Platten für 18-24 h bei 44 °C ± 0.5

°C bzw. für 72 ± 2 h bei 30 °C ± 0.5 °C aerob bebrütet.

Für die Untersuchung auf Enterobacteriaceae wurden im Doppelansatz Teilmengen von 0,1 ml der homogenisierten Proben sowie der hergestellten Verdünnungsreihe, mittels Oberflächenspatelverfahren auf Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar (VRBD-Agar, Merck, KGaA, Darmstadt, Germany) gegeben. Anschließend, wurden die VRBD-Agar-Platten im anaeroben Milieu für 48 h bei 30 °C ± 0.5 °C bebrütet.

Die Anzahl der Koloniebildenden Einheiten pro cm² (KbE/cm²) für jeden Parameter wurde anhand der gezählten Kolonien berechnet. Dafür wurden die Petrischalen aus den Verdünnungsstufen, auf denen 1 und 300 bzw. 150 Kolonien gewachsen waren, nach Ablauf der Bebrütungszeit ausgewählt. Für die Berechnung der aeroben Gesamtkeimzahl wurden alle gewachsenen Kolonien gezählt, während nur die Kolonien, die typische Morphologie auf den entsprechenden Agar-medien aufwiesen (Enterobacteriaceae: Kolonien mit rosa bis rotem Präzipitationshof auf VRBD-Agar; E. coli: Kolonien mit blauer Präzipitat auf TBX-Agar), für die Berechnung der Zahl der Enterobacteriaceae und E. coli berücksichtigt wurden.

Die von der VO (EG) 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel vorgegebenen Richt- und Grenzwerte wurden als Maßstäbe angewandt, um den hygienischen Status der untersuchten Proben zu beurteilen. Während die Bewertung der quantitativen Ergebnisse anhand der aeroben Gesamtkeimzahl einen allgemeinen Eindruck über die Hygienehandhabung der Fleischware erlaubt, weist der Gehalt an E. coli auf fäkale Kontamination während des gesamten Herstellungsprozesses hin. Die in dieser Verordnung empfohlener Kriterien gelten ausdrücklich für Hackfleisch und Faschiertes, wurden aber aufgrund der gemeinsamen technologischen Behandlungsarbeitsprozessen, die für die industrielle Herstellung von Frischfleischprodukten [unter dem Begriff „unverarbeitete Erzeugnisse“ im Sinne der VO (EG) 852/2004] durchgeführt werden, hier zur Orientierung herangezogen. Die in der vorliegenden Arbeit zugrunde gelegten Richt- und Grenzwerte für die Bewertung von durch destruktives Verfahren entnommenen Fleischproben werden in Tabelle 2 dargestellt.

MATERIAL UND METHODEN 25

Tab. 2: Prozesshygienekriterien für Hackfleisch und Faschiertes gemäß Verordnung (EG) 2073/2005 (Anh. I, Kap. 2) in Log10-Wert

Parameter befriedigend akzeptabel unbefriedigend Gesamtkeimzahl ≤ 5,70 5,70 - 6,70 > 6,70

E. coli ≤ 1,70 1,70 - 2,70 > 2,70

3.1.2 Untersuchung auf Zoonoseerreger

Zur Bestimmung der mikrobiologischen Sicherheit der verpackten Wildfleischstücke wurden die Proben quantitativ auf Koagulase-positiven Staphylokokken (§ 64 LFGB L00.00-55) sowie qualitativ auf Salmonella spp. (§ 64 LFGB L00.00-20) und L. monocytogenes (§ 64 LFGB L00.00-32) untersucht.

Zum quantitativen Nachweis von Koagulase-positiven Staphylokokken wurden im Doppelansatz Teilmengen von 0,1 ml der o.g. 1:10 homogenisierten Proben sowie der hergestellten Verdünnungsreihe, mittels Oberflächenspatelverfahren auf Baird Parker Agar (BP-Agar, Merck, KGaA, Darmstadt, Germany) überführt und für 48 h bei 37 °C ± 0.5 °C unter aeroben Bedingungen bebrütet. Nach Ablauf der Bebrütungszeit wurden die schwarze Kolonien mit oder ohne umgebendem klaren Hof erst separat gezählt, einzeln isoliert und auf St-I-Agar subkultiviert. Die auf St-I gewachsenen Isolate wurden mittels Gramfärbung, Oxidase- und Katalase-Reaktion biochemisch überprüft. Zur weiteren Identifizierung wurden ausgewählte Kolonien auf DNAse-Agar (Oxoid LTD., Hampshire, England) ausgestrichen und eine Impfkultur zur 24-stündigen Anreicherung in Hirn-Herz-Nährbouillon (Brain-Heart-Infusion, Merck, KGaA, Darmstadt, Germany) übertragen, um die Aktion des mikrobiellen Enzyms DNAse bzw. Koagulase zu überprüfen. Anhand der Anzahl der Kolonien auf dem selektiven BP-Agar, die eine positive Koagulase-Reaktion aufwiesen, wurde der Gehalt an Koagulase-positive Staphylokokken, wie für die Hygieneparameter beschrieben, berechnet.

Zur qualitativen Untersuchung von L. monocytogenes wurden zunächst jedem Fleischstück 10 g entnommen, diese mit 90 ml Halb-Fraser-Bouillon (FRASER-Listeria-Selektiv-Anreicherungsbouillon, Merck,KGaA, Darmstadt, Germany) für 120 s homogenisiert und für 24 ± 2 h bei 30 °C ± 0.5 °C aerob bebrütet. Nach Ablauf der Bebrütungszeit wurden 0,1 ml der Anreicherungsflüssigkeit in 10 ml Voll-Fraser-Medium

(FRASER-Listeria-Selektiv-26 MATERIAL UND METHODEN

Anreicherungsbouillon, Merck,KGaA, Darmstadt, Germany) überimpft und für 48 h bei 37

°C ± 0.5 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert. Nachfolgend wurde 10 µl des Homogenisats mittels Öse auf dem Selektivnährboden, Oxoid-Chromogen-Listeria-Agar- (OCLA-Agar, Oxoid LTD., Hampshire, England) ausgestrichen und für 48 h bei 37 °C ± 0.5

°C bebrütet. Verdächtige Kolonien (Blaugefärbte Kolonien mit umgebendem trüben Präzipitationshof) wurden von den Platten isoliert und auf StI-Agar subkultiviert. Die Identifizierung von L. monocytogenes erfolgte durch Überprüfung der Oxidase- und Katalase-Reaktion sowie Gramfärbung, Beweglichkeit und API LISTERIA (bioMérieux, Marcy l´Etoile, France).

Zum qualitativen Nachweis auf Salmonella spp. wurden 25 g Probenmaterial mit 225 ml gepuffertem Peptonwasser in einem Stomacherbeutel für 120 s homogenisiert. Nach aerober Bebrütung (18 bis 24 h bei 37 °C ± 0.5 °C) wurden 0,1 ml und 1 ml des Homogenisats in Magnesiumchlorid-Malachitgrün-Bouillon nach RAPAPPORT-VASSILIADIS (RVS Broth, Merck, KGaA, Darmstadt, Germany) bzw. Tetrathionat-Brilliantgrün-Galle-Bouillon (Oxoid LTD., Hampshire, England) transferiert und für 24 ± 2 h bei 42 °C ± 0.5 °C bzw. für 24 ± 2 h bei 37 °C ± 0.5 °C aerob bebrütet. Nachfolgend wurden 10 µl des jeweiligen Homogenisats mit Hilfe einer Öse auf dem Salmonella-selektiven Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar (XLD, Merck, KGaA, Darmstadt, Germany) sowie dem RAMBACH®-Agar (Merck, KGaA, Darmstadt, Germany) überführt und für 24 h bei 37 °C ± 0.5 °C inkubiert. Nach Isolierung von Kolonien typischer Morphologie (auf XLD: durchsichtbare bzw. blassrosa gefärbte Kolonien mit schwarzen Zentrum; auf RAMBACH®-Agar: Kolonien mit kirschrote Färbung) wurde das Vorhandensein von Salmonella spp. durch serologische Agglutinationstest mit polyvalentem Serum (SIFIN) und anschließende biochemische Überprüfung mittels API 20E (bioMérieux, Marcy l´Etoile, France) bestätigt.