II. MATERIAL UND METHODEN
1. Methodische Vorversuche
In den Vorversuchen sollte ein Campylobacter jejuni-Stamm gefunden werden, dessen Adhärenz- und Invasionsfähigkeit deutlich nachweisbar ist. Außerdem sollte der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen des gewählten Bakterienstammes im zeitlichen Verlauf untersucht werden, um die geeignete Infektionszeit und -konzentration als konstante Parameter für weitere Versuche festzulegen. Dieser zeitliche Infektionsverlauf sollte zusätzlich auch morphologisch unter Mikroskop beobachtet werden, um den Zustand der infizierten Zellen optisch zu bestimmen.
1.1 Auswahl eines geeigneten Campylobacter jejuni-Isolates
Um den für weitere Untersuchungen geeigneten C. jejuni-Stamm zu finden, wurde das Invasionsverhalten der zur Verfügung stehenden Isolate ATCC 33291, 84-25, 84-66, 84-77, 84-100 sowie der beiden Hühner-Isolate 10 und 11 überprüft (s. Abb. 4). Hierzu wurden humane Kolon-Karzinom Zellen der Linie CaCo-2 mit dem jeweiligen Bakterium infiziert und drei Stunden lang inkubiert. Anschließend erfolgte eine 1,5-stündige Behandlung mit 100 µg/ml Gentamicin, was die Abtötung der adhärenten, extrazellulären Bakterien zufolge hat (vgl. II.2.9.1). Die Isolate 84-25, 84-66, 84-77, 84-100 (freundlicherweise von Prof. Blaser zur Verfügung gestellt) sowie das Isolat 10 zeigten trotz eines guten Wachstums auf Platten, eine deutlich geringere Invasionsfähigkeit in die humanen CaCo-2 Zellen als das Isolat 11 und der Stamm ATCC 33291. Bei einem der Stämme, 84-66, konnte sogar überhaupt keine Invasionsfähigkeit nachgewiesen werden. Das aus Hühnerkot frisch isolierte C. jejuni-Isolat 11 invadierte in die CaCo-2 Zellen besser als die oben beschriebenen Stämme. Die beste Invasion zeigte jedoch der C. jejuni-Stamm ATCC 33291, so dass alle nachfolgenden Untersuchungen mit diesem Bakterium durchgeführt wurden.
0
Isolat 11 Isolat 10 84-77 84-25 84-100 84-66
1.2 Untersuchung des Adhärenz- und Invasionsverhaltens von C. jejuni, ATCC 33291
Zur Bestimmung der Adhärenz- und der Invasionsfähigkeit des C. jejuni Stammes ATCC 33291 wurden diese Bakterien zunächst drei Stunden mit der CaCo-2 Zelllinie, wie unter II.2.9.1 und II.2.9.2 beschrieben, inkubiert. Die adhärenten Bakterien konnten sofort im Anschluss an die Inkubation durch Lyse der humanen Zellen in 0,5 ml 0,1% Triton X-100 gewonnen werden, während für die Untersuchung der invadierten Bakterien vor der Zelllyse eine Behandlung der adhärenten Zellen mit Gentamicin erforderlich war. Für beide Versuche wurden die Mittelwerte von vier unabhängigen Untersuchungsreihen von Zellen der Passagen 7, 10, 26 und 32 zu je drei Ansätzen (Daten nicht gezeigt) als colony forming units (cfu) pro ml zusammengefasst und in der Tabelle 1 dargestellt. Bei einer Infektion mit MOI 100 betrug die durchschnittliche Anzahl der adhärenten Bakterien pro ml etwa 910.000 Zellen (s. Tab.1, Mittelwert), was eine MOI von 2 ergab. Demnach hafteten an jede humane Zelle im Durchschnitt zwei Bakterien an. Bei einer Vergleichsuntersuchung der Invasion zeigte sich, dass nur etwa 1,6% der adhärenten Bakterien auch wirklich in die Zelle eindrangen (vgl.
Tab. 1).
Passage: 7 10 26 32 Mittelwert
Adhärenz (cfu/ml)x1000 719±114 414±123 532±82 1.976±631 910±721 Invasion (cfu/ml)x1000 13±1 5±2 20±2 21±9 14±7 Anteil der adhärenten
Bakterien (cfu), die
invadierten in % 1,79 1,15 3,72 1,09 1,62
Invasion in %
Tab. 1: Untersuchung der Adhärenz- und Invasionsfähigkeit von C. jejuni Stamm ATCC 33291 in humane CaCo-2 Zelllinien der Passagen 7, 10, 26 und 10. Die Anzahl der adhärierenden bzw.
invadierenden Bakterien wurde als colony forming units (cfu) pro ml x1000 dargestellt. Die invadierten Bakterien wurden zusätzlich noch in % der adhärierenden Bakterien ausgedrückt. (Mittelwerte±
Standardabweichung)
1.3 Bestimmung der Infektionskurve
Für die Bestimmung der Infektionskurve, in welcher der zeitliche Verlauf des Absterbens der Zellen nach Infektion dargestellt ist, wurde eine MOI von 2.000, 200, 100 oder 20 eingesetzt.
Sowohl eine Erhöhung der Bakterienkonzentration als auch eine Verlängerung der Inkubationszeit mit C. jejuni führten zum verstärkten Absterben der infizierten humanen Zellen (s. Abb. 5). Nach etwa 4 h begannen die CaCo-2 Zellen, die mit einer MOI von 2.000 und 200 infiziert wurden, abzusterben, während die CaCo-2 Zellen, infiziert mit MOI’s von 100 und 20, weitere 2 h inkubiert werden konnten, ohne dass sich ihre Anzahl deutlich verringerte. Noch deutlichere Unterschiede im Einfluss der MOI auf das Sterben der humanen Zellen wurden 11 h nach Beginn der Infektion beobachtet. Zu diesem Zeitpunkt wurden bereits 83% der mit MOI 2.000 und 76% der mit MOI 200 infizierten Zellen abgetötet. Auch die mit MOI 100 infizierten Zellen zeigten eine relativ hohe, etwa 60%-ige Sterblichkeit.
Lediglich nach Infektion mit einer geringen Bakterienkonzentration (MOI 20) blieben nach 11 h im Vergleich zu den nicht infizierten immer noch 69% der Zellen vital. Nach einer weiteren Inkubation von insgesamt 27 h verringerte sich die Viabilität der CaCo-2 Zellen auf ca. 3% bei MOI 2.000 bzw. etwa 11% bei allen anderen Zellkulturen (Daten nicht gezeigt).
Alle nachfolgenden Infektionsversuche wurden deshalb mit einer MOI 100 durchgeführt.
Diese Bakterienkonzentration erlaubte einerseits eine längerfristige Durchführung von Versuchen mit lebensfähigen Zellen. Andererseits zeigte sie dennoch einen nachweisbaren Einfluss auf die untersuchten humanen Zellen.
100000 1000000 10000000
2 4 6 8 10
MOI 2000 200 100 20 nicht infiz.
0 4 6 11 13
Zellen/ ml
Zeit in h
Abb. 5: Infektionskurve von CaCo-2 Zellen, die mit unterschiedlichen multiplicties of infection (MOI) des Bakteriums Campylobacter jejuni behandelt wurden.
1.4 Untersuchung der Morphologie von infizierten CaCo-2 Zellen
Die mit einer MOI von 100 infizierten CaCo-2 Zellen wurden nach 12 h, 20 h und 36 h unter dem Mikroskop beobachtet und fotografiert (Abb. 6, A-D). Neben der Bestimmung der Lebend-Zellzahlen (vgl. III.1.3) wurde auch der Einfluss von C. jejuni auf die Morphologie der Zellen verfolgt. Nach ca. 12 h konnten, im Gegensatz zu den Ergebnissen aus III.1.3 noch keine Veränderungen in der Morphologie der infizierten Zellen festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Erst nach ca. 20 h wurde der Unterschied zu den nicht infizierten Zellen (s. Abb. 6 A) sehr deutlich. Die Form der einzelnen Zellen im Monolayer löste sich auf und es konnte nur noch ein amorphes Bild der Zellen unter dem Mikroskop beobachtet werden (s. Abb. 6 B). Gleichzeitig wurde ein Ablösen des Zellmonolayers sichtbar. Nach 36 h löste sich der Zellmonolayer vom Plattenboden komplett ab und trieb lose im Medium (s. Abb. 6 C und D). Die anschließende Zellfärbung mit Trypanblau (vgl. II.2.6.1) zeigte, dass nahezu alle Zellen zu diesem Zeitpunkt tot waren.
Abb. 6: Phasenkontrast-Aufnahmen der humanen Kolon-Karzinom Zelllinie CaCo-2; A: unbehandelte Zellen; B: Zellen nach einer 20-stündigen Infektion mit C. jejuni; C: Zellmonolayer nach 36 h Infektion mit C. jejuni; D: lose treibender CaCo-2 Zellmonolayer nach 36 h Infektion mit C. jejuni;
Maßstabsmarke: 1 mm.