3 Material und Methoden
3.1 Arbeits- und Probenmaterialen
3.2.3 Methodische Details
3.2.3.1 Dokumentation
Der Versuchsverlauf und die genauen Bedingungen des jeweiligen Ansatzes werden in einem Protokollheft für jede Probenaufbereitung, inklusive der Zwischenschritte bis zum Auftragen auf den Gaschromatographen, einzeln nach einem einheitlichen Schema festgehalten.
Material und Methoden
Abbildung 8: Schema zur Protokollierung des Verlauf der Probenaufbereitung
3.2.3.2 Vorbereitung der Apparatur
Während der Probenaufbereitung gelangen, je nach verarbeiteter Probe, unter-schiedliche Anteile dieser in den Dampfraum und werden mit dem Trägergasstrom in der gesamten Apparatur verteilt. Es ist daher erforderlich nach jeder Probenaufberei-tung, die Apparatur in ihre wesentlichen Bestandteile zu zerlegen und zu reinigen.
Pfanne und Glasteile werden hierzu mit konventionellem Geschirrspülmittel gründlich
Material und Methoden
gesäubert und anschließend sorgfältig mit klarem Wasser ausgespült, um alle Spu-ren des Reinigungsmittels vollständig zu entfernen. Vor dem nächsten Einsatz wird die Versuchsanordnung entweder mit Heißluft oder über Nacht getrocknet.
zum Vakuumcontroller
Fleischprobe
Abbildung 9: Luftstrom (Pfeile) in der Bratapparatur während der Aufheizphase; die gereinigte Umluft durchströmt die Pfanne, nicht aber Kühleinheit und Te-nax® ; das Fleisch wird erst abgesenkt, bzw. die Marinade erst zugegeben bei Erreichen der Brattemperatur (vergl. Abbildungen 7 und 10)
Vor Beginn jeder Probenaufbereitung werden die Tenax®- und SPME-Adsorptionspositionen wie oben beschrieben vorbereitet. Die Apparatur wird ver-schlossen und die Heizplatte angeschaltet. Der Unterdruck wird angelegt, wobei der Luftstrom allerdings noch nicht über die Tenaxkartusche geleitet wird. Die Abbildun-gen 9 und 10 veranschaulichen dies am Beispiel einer Fleischprobe.
Erst mit Erreichen der gewünschten Pfannentemperatur von 230 °C, wird der Luft-strom über Kühlung und Adsorbens geleitet, ein Unterdruck von 850 mbar eingestellt und die Proben in Kontakt mit dem Pfannenboden gebracht. Im Falle von Fleisch als Probe, erfolgt dies durch Absenken der unter dem Stempel befestigten Fleischschei-be. Im Falle von Marinade als Probe, durch Zugabe der entsprechenden Menge über
Material und Methoden
den mittleren der 3 NS-Hälse, der zusammen mit einem Quickfix-Adapter das Durch-führen des Proben-Stempels durch den Glasdeckel in den Garraum der Pfanne er-möglicht. Näheres zu der Vorgehensweise der Probenaufbereitung ist in den jeweili-gen Kapiteln weiter unten zu finden.
Fleischprobe zum Vakuumcontroller
Abbilung 10: Luftstrom (Pfeile) in der Bratapparatur während der Bratphase; die Probe befindet sich auf dem Pfannenboden, die freigesetzten flüchtigen Verbin-dungen gelangen mit dem Luftstrom über die Kühleinheit zu den Adsorpti-onspositionen, bzw. werden mit der Feuchtigkeit auskondensiert (vergl. Ab-bildungen 7 und 9)
3.2.3.3 Marinieren
Das portionierte Fleisch wird zunächst über 24 Stunden bei 4 °C aufgetaut. Hiernach werden mit einer Spritze und aufgesetzter Kanüle ca. 15 mL Marinade in jede Fleischscheibe injiziert, wovon etwa die Hälfte im Fleisch verbleiben. Die Stücke werden anschließend in einer verschließbaren Polyethylen-Frischhaltebox platziert und mit Marinade übergossen bis sie vollständig bedeckt sind. Die Box wird ver-schlossen und bis zur Probenaufbereitung für 6 Tage, im Falle der Rotweinmarinade und 4 Tage, im Falle der Buttermilchmarinade, bei 4 °C gelagert. Das Fleisch wurde
Material und Methoden
während dieser Zeit regelmäßig gewendet, um eine gleichmäßige Benetzung des Fleisches zu gewährleisten.
3.2.3.4 Probenaufbereitung unbehandeltes Fleisch
Vor Versuchsbeginn wird das portionierte Fleisch bei 4°C über 24 Stunden zum auf-tauen gebracht. Die aufgetauten Fleischscheiben werden mit geglühtem Bindedraht an der Unterseite des Edelstahlstempels befestigt, dieser durch den mittleren NS-Hals des Glasdeckels geführt und mittels eines Quickfixadapters fixiert. Pfanne und Deckel werden mit der Flanschklemme verbunden und die Apparatur so verschlos-sen. Bis zum Erreichen der entsprechenden Pfannentemperatur von 230 °C, ver-bleibt der Stempel unterhalb des Glasdeckels. Sobald der Pfannenboden die Brat-temperatur erreicht hat, die Kontrolle erfolgt mit Hilfe eines Infrarotthermometers, wird der Luftstrom wie in Kapitel 3.2.3.2 beschrieben umgeleitet und eine Standard-lösung (100 µL Dodecansäure 350 µg) in den Garraum pipettiert. Alternativ wurde ein weiterer interner Standard zugegeben (Pyridin), der aber zur Auswertung nicht verwendet wurde. Die Zugabe der Standardsubstanz und die tatsächliche Rückge-winnung beim Bratendurchgang, dienen der Beurteilung der Qualität desselben. Un-mittelbar anschließend wird der Stempel mit dem Fleisch auf den Pfannenboden ab-gesenkt und es wird ein leichter Anpressdruck ausgeübt, um ein möglichst vollstän-diges Aufliegen des Fleisches auf dem Pfannenboden zu erreichen. Die Fleisch-scheiben werden beidseitig gebraten. Zum Wenden der FleischFleisch-scheiben wurde der Trägergasstrom wieder umgeleitet, wie in Abbildung 9 zu sehen, die Apparatur ge-öffnet und die Pfanne mit klarem Wasser gereinigt. Ziel ist es das Fleisch praxisnah zuzubereiten, d. h. die Dauer des Bratvorgangs ist nicht exakt definiert. Mittels Sicht-kontrolle durch den Glasdeckel werden die Fleischstücke bis zum Erreichen einer guten Bräunung, in der Regel 5-6 Minuten für die erste Seite und 2-3 Minuten für die zweite Seite, gebraten. Insgesamt wurden so etwa 350 Gramm Fleisch gebraten, was in der Regel 3 Fleischscheiben entspricht, die nacheinander beidseitig gebraten wurden.
Material und Methoden
3.2.3.5 Probenaufbereitung mariniertes Fleisch
Die Verarbeitung des marinierten Fleisches erfolgt analog zu der des nicht marinier-ten Fleisches. Allerdings ist in der Regel eine etwas längere Bratdauer nötig, da sich der höhere Feuchtegehalt der Probe auf die Bratentemperatur auswirkt.
3.2.3.6 Probenaufbereitung mit Rotwein
Auch hier wurden die zwei o. g. Standardlösungen vor Beginn der eigentlichen Pro-benaufbereitung zugegeben. Bei der Aufbereitung der Rotweinmarinade wurden ins-gesamt 80 mL eingesetzt, die nacheinander über den mittleren Hals des Glasdeckels in Portionen zu jeweils 20 mL zugegeben wurden. Vor Zugabe der nächsten Portion wird abgewartet bis das vorherige Quantum nahezu vollständig einreduziert ist, wo-bei allerdings ein Verkohlen verhindert werden muss. Der eingedampfte Rotwein verbleibt in der Pfanne und wird durch Zugabe der nächsten Portion resuspendiert.
Die gesamte Bratendauer beträgt somit in der Regel ca. 8 Minuten. Pfannentempera-tur und angelegter Unterdruck werden wie beim Braten der Fleischproben gewählt.
3.2.3.7 Probenaufbereitung mit Buttermilch
Bei der Aufbereitung der Buttermilch wurden insgesamt 3 Bratdurchgänge mit jeweils 60 mL, insgesamt also 180 mL, Buttermilch nacheinander durchgeführt. Zwischen jedem Durchgang wurde die Pfanne mit klarem Wasser gereinigt. Die 60 mL jeden Durchgangs wurden nach und nach zu jeweils 20 mL über den mittleren NS-Hals des Glasdeckels zugegeben. Analog zum Rotwein, wurde das nächste Quantum erst zu-gegeben nachdem die vorherige Portion einreduziert war ohne zu stark zu Bräunen.
Die gesamte Bratendauer betrug hierbei ca. 3 mal 5 Minuten. Pfannentemperatur und angelegter Unterdruck werden ebenfalls wie beim Braten der Fleischproben ge-wählt. Die Zugabe der Standardsubstanzen erfolgte auch hier vor der eigentlichen Probenaufbereitung.
Material und Methoden
3.2.3.8 Elution der Aromastoffe vom Tenax®
Die Überführung der leicht flüchtigen Substanzen vom Adsorbens in ein geeignetes Lösungsmittel stellt den letzten Schritt der Probenaufbereitung bezüglich der Tenax-Adsorptionsstrecke dar. Hierzu wird die Tenax®-Kartusche unmittelbar nach Beendi-gung der Bratdurchgänge mit 3 mL Diethylether gespült und die flüchtigen Substan-zen so vom Adsorbens eluiert. Das so gewonnene Eluat wird unter einem seichten Stickstoffstrom auf etwa 150 µL eingeengt. Um bei der Quantifizierung von Konzen-trationsschwankungen, welche durch das Einengen verursacht werden, unabhängig zu bleiben, wird das genaue Gewicht des konzentrierten Eluates mit einer Feinwaage auf 1 µg genau bestimmt. Als Alternative zur Gewichtsbestimmung wurde vor dem Einengen eine definierte Menge einer Standardlösung zupipettiert, die aber nicht zur Auswertung herangezogen wurde.
3.2.3.9 Extraktion der Aromastoffe aus Kondensat
Die im Kondensat gelösten Aromastoffe müssen zunächst aus der wässrigen Lösung in ein geeignetes Lösemittel überführt werden, was analog zur Elution des Tenax®, den letzten Schritt der Probenaufbereitung bezüglich der Gewinnung der über das Kondensat gewonnenen Aromastoffe darstellt. Hierzu wird das Volumen des Kon-densates bestimmt und dieses in einen Scheidetrichter überführt und mit Diethylether (¼ des Kondensatvolumens) ca. 2 Minuten ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird verworfen, bzw. für eventuelle weitere Analysen zurück gestellt, und ebenfalls wie oben bereits beschrieben eingeengt.
3.2.3.10 Solid Phase Microextraction (SPME)
Unmittelbar vor Beginn des eigentlichen Bratenvorgangs und noch vor Zugabe der Standardsubstanzen, wird die Faser aus der schützenden Hülse herausgeschoben.
Faserhalter und Einstellung des SPME-Halters sind so gewählt, dass die Spitze der Faser gerade kurz vor dem Zentrum der vertikalen Achse der beiden Dimrothkühler
Material und Methoden
endet. Dadurch ist eine möglichst nahe Position an den Bratendämpfen gewährleis-tet, ohne dass die Spitze von, vom oberen Kühler abtropfenden, Kondenswasser ge-troffen werden kann.
3.3 Analyse
3.3.1 Messeinheit
Die Analyse der aufbereiteten Proben erfolgte mit einem Gaschroma-tographie/Massenspektroskopie-System. Die Funktionsweise wird in Abbildung 11 verdeutlicht.
Abbildung 11: Schematische Darstellung der Funktionsweise des GC/MS-Systems
<<<
Material und Methoden
Für alle Analysen gelten die folgenden Parameter. Unterschiede der einzelnen Me-thoden werden in Kapitel 3.3.2 aufgeführt. Bei der Steuerungssoftware für das GC/MS-System handelt es sich um HP G3410 ChemStation, Version C03.00
Gaschromatographie:
§ Gerätetyp: HP 5890 Series II GC mit HP 7673 Autosampler;
Hewlett-Packard, Palo Alto, USA
§ 1. Trennsäule: Kapillarsäule, CP-Wax 52 CB;
60 m x 0,25 mm x 0,25 µm; Varian, Palo Alto, USA
§ 2. Trennsäule: Kapillarsäule, DB-5,
30 m x 0,32 mm x 1,00 µm; Agilent Technologies, Santa Clara, USA
§ Injektortyp: splitless
§ Trägergas: Helium, Reinheitsgrad 4.6; Fa. Linde, München
§ Säulenvordruck: 80 kPa
§ Injektortemp.: Methodenabhängig, siehe dort
§ Flussrate: Methodenabhängig, siehe dort
§ Temperaturprog.: Methodenabhängig, siehe dort
Massenspektrometrie:
§ Gerätetyp: HP 5989 A MS; Agilent Technologies, Santa Clara, USA
§ Ionisationsform: Elektronenstoß-Ionisation (EI)
§ Ionenquellentemp.: 200 °C
§ Ionisierungsenergie: 70 eV
§ Quadrupoltemp.: 150 °C
§ Tuning: standard autotune
§ EM-Voltage: relative
§ Solvent Delay: Methodenabhängig, siehe dort
Material und Methoden
Das Prinzip der Massenspektrometrie beruht auf der Fragmentierung der zu Identifi-zierenden Verbindung, wobei ein charakteristisches Set von Molekülfragmenten (Massenspektrum) entsteht. Bei der Aufnahme eines Massenspektrums wird vom Detektor die Intensität der Ionen in Abhängigkeit vom Masse/Ladungsverhältnis re-gistriert. Die analogen Signale (Gauß-Kurven) werden zu einem Strich zusammenge-fasst und man erhält ein Strichspektrum. Dieses Massenspektrum kann in Form einer Tabelle oder in der übersichtlicheren, grafischen Form angegeben werden. Abbil-dung 12 zeigt beispielhaft das grafisch dargestellte Massenspektrum am Beispiel von 2,3-Octandion.
Auf der Ordinate wird die relative Intensität der Ionen, auf der Abszisse das Mas-se/Ladungsverhältnis dargestellt. Die absolute Intensität wird meist nur als Zahl für den intensivsten Peak angegeben. Das Signal bei der höchsten Masse stellt (von wenigen Ausnahmen abgesehen) den Molekülionenpeak dar. Aus diesem Peak kann direkt das Molekulargewicht der Probe entnommen werden. Da die Atome, aus de-nen organische Moleküle aufgebaut sind, auch natürliche Isotope enthalten, werden die Peaks in Massenspektren von einem oder mehreren so genannten Isotopen-peaks begleitet. Aus den Intensitätsverhältnissen der IsotopenIsotopen-peaks kann die Sorte und Anzahl der Atome, die in der Probe enthalten sind, ermittelt werden.
Alle Signale im Massenspektrum, deren Masse kleiner als die des Molekülions ist, entstehen durch eine Fragmentierung der Probemoleküle. Man nennt diese Peaks Fragmentionenpeaks. Sie liefern Aussagen über die Struktur des Analyten.
Der Basispeak ist das Signal mit der höchsten Intensität. Darauf bezieht man sich bei der Berechnung der relativen Intensität aller anderen Peaks.
Material und Methoden
Abbildung 12: Strukturformel und Massenspektrum von 2,3-Octandion; nicht alle Peaks wurden bezeichnet
3.3.2 GC/MS-Methoden
Im Rahmen der Analyse der Aromastoffe war es erforderlich unterschiedliche Metho-den einzusetzen. So erfordert die Analyse der mittels SPME extrahierten Aromastof-fe eine andere GC/MS-Methodik als die Untersuchung von Aromakonzentraten aus Tenax®-Eluat oder Kondensatkonzentraten. Ebenso müssen auch für die verwende-ten Kapillarsäulen verschiedene GC-Bedingungen gewählt werden. Auch zur Quanti-fizierung der ausgesuchten Verbindungen in den Aromaextrakten, müssen andere Parameter am Massenspektrometer gewählt werden. Die Methoden werden durch die Anpassung der einzelnen Parameter in der GC/MS-Steuerungssoftware einge-richtet und gespeichert.
Material und Methoden
Grundsätzlich muss zwischen Scan- und SIM-Methoden unterschieden werden. Me-thoden mit Scan-Modus sind geeignet um Vollspektren aufzunehmen und so Über-sichtschromatogramme zu generieren. Mit diesen Chromatogrammen lassen sich in den Stoffdatenbanken nach ähnlichen Massenspektren suchen und so Vorschläge zu den gefundenen Substanzen erhalten oder unbekannte Massenspektren interpre-tieren. Im Scan-Modus werden nacheinander zahlreiche unterschiedliche Ionenmas-sen „gescannt“, was mit einer reduzierten Empfindlichkeit erkauft wird, da für eine bestimmte Ionenmasse nur eine kurze Messzeit zur Verfügung steht.
Der SIM-Modus (Selected Ion Monitoring) bietet die Möglichkeit nur wenige ausge-wählte Ionenmassen zu registrieren. Durch die längere Messzeit je Ion wird eine hö-here Empfindlichkeit erreicht, wodurch sich dieser Modus zur Quantifizierung ausge-wählter Zielsubstanzen eignet. Bei der Auswahl der SIM-Massen sind, sofern mög-lich, intensive Ionen des Ziel-Analyten im oberen Massenbereich (Molekülion, inten-sive Fragmentionen) zu wählen. Der GC-Retentionsbereich kann für die Messung mehrerer Analyten in einem Lauf in Zeitfenster mit unterschiedlichen SIM-Massen unterteilt werden (SIM-Tabelle). Die Auswahl der Zielionen in Verbindung mit der Ein-richtung eines entsprechenden Zeitfensters stellt sicher, dass nur der gewünschte Analyt erfasst wird.
Material und Methoden
Im Folgenden sind die Hauptparameter der GC/MS-Methoden, mit denen die vorge-stellten Ergebnisse gewonnen wurden, vorgestellt.
— GC/MS-Methode: GL_MOD2
Die GL_MOD2-Methode wurde als Standardmethode (Scan) zur Analyse der Aroma-konzentrate, also aus Tenax®-Trap und Kondensat, mit der 1. Trennsäule benutzt.
GL_MOD2
Ofentemp. Initial 40 °C für 5 min.
Ofentemp. Anstieg 5°C / min.
Ofentemp. Ende 200°C für 30 min.
— GC/MS-Methode: TRENN_2
TRENN_2 war Standardmethode (Scan) für die Analyse der mittels SPME gewonn-nen Aromastoffe, ebenfalls für die erste Trennsäule.
TRENN_2
Ofentemp. Initial 40 °C für 10 min.
Ofentemp. Anstieg 5°C / min.
Ofentemp. Ende 200°C für 15 min.
Material und Methoden
— GC/MS-Methode: Q_MAR
Mit Q-Mar wurde die Quantifizierung der ausgewählten Komponenten der Rotwein-marinierung durchgeführt. Diese ist eine SIM-Methode. Die GC/MS-Parameter sind identisch mit denen der GL_MOD2-Methode.
Q_MAR
Verbindung Beginn des Zeitfensters (min) Zielionen
Ethylbutansäureester 8,00 71;88
Ebenfalls auf GL_MOD2 basierende Methode zur Quantifizierung (SIM) der Zielsub-stanzen (ausgenommen der aliphatischen Carbonsäuren) der Buttermilchmarinie-rung. Die GC/MS-Parameter sind identisch mit denen der GL_MOD2-Methode, mit Ausnahme des Solvent Delays, der auf 7,0 Minuten verkürzt wurde.
SIM_BM
Verbindung Beginn des Zeitfensters (min) Zielionen
2,3-Butandion 7,00 86
Material und Methoden
— GC/MS-Methode: Q_BM_S
Methode zur Aufnahme der Kalibrierkurven für die Quantifizierung (Scan) der alipha-tischen Carbonsäuren, basierend auf GL_MOD2 mit idenalipha-tischen Parametern.
— GC/MS-Methode: JW_2
Die Standardmethode (Scan) zur Analyse der Aromakonzentrate mit der zweiten Trennsäule.
Ofentemp. Initial 40 °C für 5 min.
Ofentemp. Anstieg 5°C / min.
Ofentemp. Ende 200°C für 20 min.
— GC/MS-Methode: JW_S
JW_S war Standardmethode (Scan) für die Analyse der mittels SPME gewonnnen Aromastoffe mit der zweiten Trennsäule.
JW_S
Ofentemp. Initial 40 °C für 10 min.
Ofentemp. Anstieg 5°C / min.
Ofentemp. Ende 200°C für 15 min.
Material und Methoden