Methoden zur Analyse von Biofilmen und Mikroorganismen

In verschiedensten Bereichen, wie der Medizin, Biologie und technischen Pro-zessen, sind die Charakterisierung und Identifizierung von Mikroorganismen, sowie detaillierte Informationen über die biochemische Zusammensetzung des sie umgeben-den EPS von großer Bedeutung. Vor allem kann dieses Wissen in der Krankheitsdiag-nostik, in der Entwicklung neuer Antibiotika, Biozide und Reinigungsmittel, in der Er-forschung neuer Methoden zur Vermeidung von Biofouling, sowie in der Wasseraufbe-reitung eingesetzt werden.

Die tatsächliche chemische Zusammensetzung und Struktur der Biofilme variiert jedoch stark. Sie ist dabei abhängig von mehreren Faktoren: den vorhandenen mikro-biellen Zellen, ihrer metabolischen Aktivität, den verfügbaren Nährstoffen, den vorherr-schenden physikochemischen Bedingungen (Temperatur, Flussbedingung, pH usw.) und der Stufe der Biofilmentwicklung. In den letzten Jahrzenten wurden verschiedenste Techniken zur Identifizierung und Charakterisierung von Biofilmen, deren Molekular-struktur und den zugehörigen biochemischen Funktionen verwendet und entwickelt [26]. Eine schematische Übersicht über diese Methoden findet sich in Abbildung 2. Es existieren klassische chemische und biochemische Methoden wie zum Beispiel das Pro-filing von Fettsäuren, Nukleinsäure oder genetische Verfahren und Proteomik im All-gemeinen. Üblicherweise sind diese Methoden allerdings sehr zeitaufwendig, arbeitsin-tensiv, benötigen teure Ausrüstung, hoch ausgebildetes Personal und zeigen dabei aber nur eine eingeschränkte Reproduzierbarkeit und Spezifität. Weiterhin ist die Identifizie-rung von Mikroorganismen in einer Mischung verschiedener Bakterientypen nahezu unmöglich [26,27].

Abbildung 2 Verschiedene gebräuchliche analytische Methoden zur Untersuchung von Biofilmen (nach [26]).

Eine andere häufig verwendete Methode ist Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung.

(FISH). Diese Methode erlaubt die Detektion unterschiedlicher Mikroorganismen in einem Biofilm bestehend aus verschiedenen Arten, indem mit rRNA koppelnde Nukle-insäure-Sonden verwendet werden [28,29]. Zur Biofilmanalyse wird FISH häufig mit Fluoreszenz-induzierter konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (confocal laser scan-ning microscopy, CLSM) kombiniert [28]. Durch diese Vorgehensweise wird es ermög-licht zerstörungsfreie und dreidimensionale Informationen über die Struktur und den Aufbau des Biofilms zu erhalten [30,31]. Allerdings ist die Probenvorbereitung relativ aufwändig und das Anfärben der EPS-Matrix ziemlich kompliziert und teuer, da die EPS aus einer komplexen Mischung verschiedener Biopolymere mit einer großen An-zahl an Bindungsstellen bestehen. Deswegen ist üblicherweise eine zeitgleiche Analyse von maximal zwei Biofilm-Komponenten mit CLSM möglich [26]. Weiterhin ist die örtliche Auflösung auf einige Mikrometer limitiert. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Rasterelektronenmikroskopie (REM) die Visualisierung eines Biofilm mit einer deutlich höheren örtlicheren Auflösung. Örtliche Auflösungen bis in den nm-Bereich hinein

können hierbei erreicht werden. Allerdings beinhaltet die übliche Probenvorbereitung in der Elektronenmikroskopie die Fixierung oder Trocknung der Probe. Dies kann große Auswirkungen auf die Morphologie des Biofilms haben, was direkt die Reproduzierbar-keit und Authentizität der Bilder beeinträchtigt [32]. Um die Veränderung der EPS-Matrix während der Probenvorbereitung zu vermeiden, können Niedrigtemperatur-REM (Cryo-REM) oder Niedrigdruck-REM (environmental scanning electron microscopy, ESEM) für die Analyse von unfixierten Biofilmen verwendet werden [26]. Eine andere Technik zur Visualisierung von Biofilmen ist die optische Kohärenztomografie (optical coherence tomography, OCT). Die örtliche Auflösung dieser Methode ist deutlich nied-riger als bei der REM. Allerdings ist es ohne Anfärben der Probe möglich in situ in 2-D und 3-D die Biofilmstrukturen abzubilden und die Biofilmverteilung und -ablösung zu beobachten [33,34]. Zusätzlich zu den bereits beschriebenen Techniken, kann die Ana-lyse der Topographie, sowie der mechanischen und physikalischen Eigenschaften des Biofilms mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (atomic force microscopy, AFM) im nm-Bereich durchgeführt werden [35]. Wenn dagegen eine tiefenaufgelöste Analyse der physikalischen Eigenschaften, wie beispielsweise Biofilmdichte oder -dicke, von Inte-resse ist, kann die photoakustische Spektroskopie (photoacoustic spectroscopy, PAS) genutzt werden. Diese erlaubt eine Analyse in Tiefen von mehr als 1 cm und kann an-gewendet werden, um das Biofilmwachstum oder die Biofilmablösung mit hoher zeitli-cher Auflösung zu untersuchen [36]. Zur Charakterisierung von Biofilmen kann auch die Festphasen-Kernspinresonanzspektroskopie (solid state nuclear magnetic reso-nance, ssNMR) benutzt werden, wobei eine ortsaufgelöste Analyse hierbei nicht mög-lich ist [37]. Die Charakterisierung, Identifizierung und bildmög-liche Darstellung der Bio-filmmatrixzusammensetzung ist auch mit verschiedenen massenspektroskopischen (MS) Methoden möglich. Verwendet werden unter andrem Sekundärionen-Massenspektrometrie (secondary ion mass spectrometry, SIMS), Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) und Desorptions-Elektrospray-Ionisation (desorption electrospray ionization, DESI). Aller-dings erfordern diese MS-basierten Techniken eine recht aufwändige Probenvorberei-tung, sind destruktiv und die Messung erfordert einen hohen instrumentellen analyti-schen Aufwand. Auch ist die Quantifizierung der betrachteten molekularen Spezies eine große Herausforderung für MS-basierte bildgebende Verfahren [26].

Zuletzt existieren noch Schwingungsspektroskopie-basierte Methoden, haupt-sächlich Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR) und Raman-Spektroskopie (Raman spectroscopy, RS). Beide Me-thoden liefern komplementäre Informationen über die Eigenschaften des Biofilms auf molekularer Ebene [38,39]. Diese schwingungsspektroskopischen Methoden basieren auf der Veränderung des Dipolmoments (IR) oder der Polarisierbarkeit des Moleküls (RS). Die beteiligten molekularen Schwingungen werden über die Absorption des ein-gestrahlten Lichts oder über die inelastische Streuung der Photonen angeregt. Die unter-schiedlichen physikalischen Prinzipien beider Methoden führen zu unterunter-schiedlichen Intensitäten der gleichen Bindungen. Beispielsweise ist die O−H-Streckschwingung in

IR-Spektren stark ausgeprägt, in Raman-Spektren jedoch nur schwach sichtbar. Daher ist RS besser geeignet für die Analyse von wasserhaltigen Proben, wie Bakterien oder Biofilmen.

Eine Reihe von Raman-basierten Methoden stehen heutzutage bei der Analyse von mikrobiologischem Probenmaterial zur Verfügung. Die nächsten Kapitel dieser Arbeit sind deswegen diesen Methoden gewidmet, um einen detaillierten Überblick über diese Techniken zu vermitteln. Da sich diese Arbeit mit der Analyse mikrobiologi-scher Proben beschäftigt, wird insbesondere auf diejenigen Eigenschaften eingegangen, welche eine wichtige Rolle bei der Analyse mikrobiologischer Proben spielen. Vorweg ist eine Übersicht über diese Methoden, die sich insbesondere auf deren mikrobiologi-schen Anwendungen bezieht, in Tabelle 1 zu finden.

Tabelle 1 Übersicht über Raman-basierte Methoden zur Analyse von mikrobiologischen Proben und Biofilmen mit Vorteilen, Limitierungen und Anwendungen

Technik Vorteile Nachteile Anwendungen

• Laterale Auflösung im µm-Bereich

Resonanz-RM • Hohe Nachweisstärke und Selektivität

• Schnelle Analyse

• Chromophor notwendig

• Photobleichung

• Biochemisches Imaging

• Schnelle Identifizierung und Charakterisierung von

• Abhängig vom Analyten und der Absorptionsstelle

• Biochemisches Imaging

• Schnelle Identifizierung und Charakterisierung von Mik-roorganismen und EPS

• Analyse des quorum sensing

Spitzenverstärkte

• Verunreinigung der Spitze

• Bisher keine Untersuchungen in situ gezeigt