1. Zusammenfassung
1.1. Einführung
1.1.8. Methoden
Promoter-‐Region und erhöhten Leptin-‐Serum-‐Spiegeln einerseits und gesteigertem Craving im Verlauf des Alkoholentzuges andererseits [99].
Diese Ergebnisse könnten, gestützt auch durch eine vorherige Studie, die zu Beginn des Entzugs von Alkohol erhöhte Leptin-‐Serumwerte zeigte, die im Verlauf des Entzugs deutlich abnahmen [27], auf eine dynamische Rolle der LEP-‐Promoter-‐Methylierung im Alkoholentzug hindeuten. Auch bei letztgenannter Studie korrelierte der Serum-‐Leptin-‐
Wert deutlich mit dem subjektiv empfundenen Craving der Probanden.
Bei Patienten mit schädlichem Gebrauch von Alkohol in der Anamnese zeigte sich darüber hinaus vor der Lebertransplantation eine deutlich höhere Methylierungsrate des Leptin-‐Promoters als bei Patienten ohne positive Anamnese für Alkohol [100].
1.1.7. Ziel der Studie
Das Ziel unserer Studie war es, anhand eines Tiermodells für Alkoholabhängigkeit herauszufinden, ob sich der Methylierungsstatus der Leptin-‐Promoter-‐Region im Verlauf des Alkoholentzugs dynamisch verändert. Des Weiteren sollte anhand des Leptin-‐
Plasmaspiegels im Blut überprüft werden, ob sich mit einem potenziell veränderten Methylierungsstatus einhergehend auch die Expression des Hormons Leptin während des Entzuges von Alkohol verändert.
Darüber hinaus sollte der Effekt einer Behandlung mit dem endogenen Opioid ß-‐
Endorphin und dem Melanokortin Alpha-‐MSH auf den Methylierungsstatus der LEP-‐
Promoterregion während des Alkoholentzugs untersucht werden, um mögliche Wechselwirkungen mit anderen neurobiologischen Signalwegen offenzulegen.
1.1.8. Methoden
Der Tierversuch wurde auf Basis des in vorhergegangenen Studien bereits etablierten Langzeit-‐Alkohol-‐Selbstverwaltungsmodells nach Spanagel und Holter [101]
durchgeführt. Dazu wurden neunzig 28-‐Tage alte Wistar-‐Ratten einzeln in Makrolon Typ-‐
3-‐Käfigen gehalten. Dabei hatten diese unbegrenzt Zugang zu Nahrung und Leitungswasser.
Die Tiere wurden in Gruppen zu je zehn aufgeteilt, davon dienten drei Gruppen in der Folge als Kontrollgruppen, sechs als Versuchsgruppen.
Nach zwei Wochen zur Akklimatisierung wurden den Versuchsgruppen drei zusätzliche Behältnisse mit jeweils 5%, 10% und 20% Ethanol-‐Lösung zur Verfügung gestellt, wohingegen den Kontrollgruppen drei zusätzliche Behältnisse mit Leitungswasser präsentiert wurden. Alle vier Wochen und zehnmal insgesamt während der Versuchszeit
18
von der 24h-‐Alkoholgruppe mit den Wasser-‐Kontrollen einerseits und der 0h-‐
Alkoholgruppe andererseits konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden.
Zum Vergleich der Behandlungsgruppen α-‐MSH, β-‐Endorphin und Kochsalz-‐Lösung nahmen wir zusätzlich die 6d-‐Alkohol-‐Kohorte als Referenzgruppe, die unbehandelt dem Entzug ausgesetzt war.
Zwischen den Behandlungsgruppen (ANOVA: F [3.35] = 4.763, p = 0.0069) konnten wir einen signifikant höheren Methylierungsstatus der LEP-‐Promoterregion bei den α-‐MSH behandelten Tieren im Vergleich zu den mit NaCl behandelten Tieren feststellen (p = 0.046). Im Gegensatz dazu konnte für die Behandlungsgruppe mit β-‐Endorphin kein signifikanter Unterschied in der durchschnittlichen LEP-‐Promoter-‐Methylierung im Vergleich zu den anderen Behandlungsgruppen bzw. der 6d-‐Ethanol-‐Kohorte festgestellt werden (END vs. 6d: p = 0.2064; END vs. SAL: p = 0.3947; END vs. MSH: p = 0.6710).
Nebenbei bemerkt konnte jedoch auch ein signifikanter Unterschied zwischen der Behandlungsgruppe Kochsalz und der 6d-‐Ethanol-‐Kohorte festgestellt werden (6d vs. Sal:
p = 0.0058), die wiederum in der Methylierungsrate den Wasserkontrollgruppen ähnelt (6d vs. WATER: p > 0,9999).
Bei den Leptin-‐Plasma-‐Werten aus dem ELISA konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden.
1.2. Diskussion
Soweit bekannt, ist die vorliegende Studie die erste longitudinale Untersuchung, die die Dynamik der LEP-‐Promoter-‐Methylierung und der Leptin-‐Protein-‐Expression während des frühen Alkoholentzugs in einem Tiermodell für Alkoholabhängigkeit untersucht.
Dabei ergab sich ein signifikant geringerer durchschnittlicher Methylierungsstatus der Alkoholgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe zum Zeitpunkt 0h.
Unter Annahme eines funktionellen Zusammenhangs zwischen epigenetischer Regulierung mittels DNA-‐Methylierung und der Protein-‐Expression sind die Ergebnisse in Einklang zu bringen mit vorherigen Studien am Menschen, die bei Patienten mit chronischem Alkoholkonsum erhöhte Leptin-‐Plasma-‐Werte im Vergleich zu gesunden Kontrollgruppen gefunden haben [24]. Diese Hypothese wird gestützt durch die in Studien belegte Annahme, dass eine geringere LEP-‐Promoter-‐Methylierung im Allgemeinen mit einer erhöhten Genexpression [94] und daraus folgend auch mit erhöhten Hormonwerten im Serum einhergeht.
19
Darüber hinaus wurde bereits über einen Zusammenhang zwischen initial erhöhter LEP-‐
Promoter-‐Methylierung und abnehmenden Leptin-‐Serum-‐Werten während des Entzuges berichtet. Die vorliegenden Ergebnisse unserer longitudinalen Studie bestätigen die Ergebnisse der vorherigen Studie von Hillemacher et al. am Menschen [99].
Unsere Befunde zeigen darüber hinaus, dass die Methylierungsraten der wassertrinkenden Kontrollgruppen über die verschiedenen Zeitpunkte der Probenentnahme konstant bleiben, wohingegen die durchschnittliche Methylierungsrate der Alkoholgruppen dynamisch steigt.
Analog dazu, dass Wurst et al. [25] in ihrer Studie sich normalisierende Leptin-‐Serum-‐
Werte im Verlauf der Abstinenz von Alkohol zeigten, zeigen unsere Daten eine Adaption der durchschnittlichen LEP-‐Promoter-‐Methylierung an die der Kontrollgruppen im Verlauf des Entzugs.
Eine mögliche Erklärung dafür bietet der Einfluss von Ethanol auf den Fettmetabolismus und die Leptin-‐Regulation. Ethanol-‐Aufnahme hemmt dabei β-‐3-‐Adrenorezeptoren und die basal-‐vermittelte Lipolyse [106-‐109]. In der Folge kann ein Anstieg der Leptin-‐
Expression beobachtet werden [110].
Als epigenetischer Regulationsmechanismus geht dabei eine verminderte Methylierung der LEP-‐Promoter-‐Region mit einer erhöhten Leptin-‐Expression einher [94].
Entsprechend würde hypothetisch umgekehrt der Entzug von Alkohol (Ethanol) mit einer erhöhten Lipolyse einhergehen. Eine erhöhte Lipolyseaktivität mündete wiederum in einer Abnahme des Leptin-‐Spiegels, die durch eine subsequentiell erhöhte LEP-‐Promoter-‐
Methylierung als konterregulatorischer Mechanismus bedingt sein könnte. Diese Hypothese könnte ebenfalls als Erklärung für die steigenden LEP-‐Promoter-‐
Methylierungsraten in unseren alkoholentzügigen Ratten dienen, die sich im Verlauf denen der Wasser-‐trinkenden Kontrollen zum Zeitpunkt 0h angleichen.
Verminderte Leptin-‐Spiegel gehen dabei der hormonellen Wirkung nach mit erhöhtem Appetit einher. Gesteigerter Appetit und Gewichtszunahme im Entzug stellen eine vieldiskutierte Hypothese in der Abhängigkeitsforschung dar. So sind sowohl Alkoholaufnahme als auch Nahrungsaufnahme konsumierende Verhaltensweisen, was sich wie oben beschrieben auch in einer wechselseitigen Beeinflussung auf neurobiologischer Ebene äußern könnte [111]. Alkoholentzug könnte dabei als Verlust einer potentiellen Energiequelle gesehen werden, der in einer veränderten Appetitregulation mündet.
21
Antagonisten wie AgRP auf der anderen Seite zeigten [74]. α-‐MSH oder weitere Melanocortin-‐Rezeptor-‐Agonisten könnten somit zukünftig als eine mögliche Therapieoption bei Patienten im Alkoholentzug in Frage kommen. Das jüngst zur Behandlung von Übergewicht entwickelte Medikament Setmelanotide, ein selektiver Agonist am Melanocortin-‐4-‐Rezeptor, über den die Regulation der Nahrungsaufnahme vermittelt wird, zeigte bei Patienten mit Leptin-‐Rezeptor-‐ bzw.
Proopiomelanocortinmangel eine signifikante Gewichtsreduktion [116, 117]. Eine Untersuchung der Wirkung im Zusammenhang mit Alkoholkonsum erfolgte bislang nicht.
In einer weiteren wissenschaftlichen Veröffentlichung jüngeren Datums auf Basis des oben beschriebenen Versuchsaufbaus konnte bei den α-‐MSH-‐ und den mit Kochsalz behandelten Tieren jedoch keine Veränderung in Bezug auf das Trinkverhalten nach Alkoholentzug festgestellt werden, wohingegen die mit β-‐Endorphin behandelten Tiere sogar deutlich mehr Alkohol nach der Entzugsperiode konsumierten als zuvor [118]. Die Behandlung mit β-‐Endorphin könnte also sogar im Gegenteil zu einer Verstärkung des Substanzverlangens nach Alkoholentzug führen. Dieser Effekt ist bereits in vorherigen Studien aufgefallen. So sind Opioid-‐Agonisten mit erhöhtem Craving in Zusammenhang gebracht worden. Beta-‐Endorphin geht zudem mit einer Suppression der α-‐MSH Aktivität einher [5], die sich – wie oben beschrieben – ungünstig auf das Substanzverlangen auswirken könnte.
In der vorliegenden Studie zeigte sich keine signifikante Veränderung des Methylierungsstatus der LEP-‐Promoterregion bei Behandlung mit beta-‐Endorphin im Vergleich zu den anderen Behandlungsgruppen bzw. den Kontrollgruppen, sodass andere Regulationsmechanismen zur Erklärung des oben erläuterten Effekts in Betracht gezogen werden müssen.
Dabei sollte auch der Unterschied in der Bestimmung des Cravings zwischen humanen und tierexperimentellen Studien berücksichtigt werden. Während in humanen Studien das Ausmaß des Cravings zumeist mithilfe von Fragebögen zur Selbstauskunft bestimmt wird und damit dem subjektiven Empfinden des Probanden unterliegt, kann dieses in tierexperimentellen Studien dem Alkohol-‐Deprivationseffekt folgend aus der Menge konsumierten Alkohols mathematisch abgeleitet werden [101]. Entsprechend ist die Vergleichbarkeit humaner und tierexperimenteller Studien hinsichtlich des Cravings bei Alkoholabhängigkeit auf methodischer Ebene nur eingeschränkt gegeben.
22
Eine wesentliche Limitation unserer Studie liegt darin begründet, dass wir nur Material aus peripheren Blutzellen genutzt haben. Die Verwendung peripheren Blutes ist aufgrund der unkomplizierten Gewinnung insbesondere mit Blick auf die potenzielle klinische Nutzbarkeit im Verlauf zunächst naheliegend. Es bleibt dabei jedoch zu bedenken, dass Leptin zwar größtenteils peripher in den Adipozyten produziert wird, ein nicht zu vernachlässigender Teil aber – wie eingangs beschrieben – auch von Teilen des zentralen Nervensystems. Mögliche zentrale Prozesse und Unterschiede zwischen zentraler und peripherer Leptin-‐Modulation konnten so nicht berücksichtigt werden. Nachdem Hypothalamus und Hypophyse jedoch eine zentrale Rolle in der Funktion der HPA-‐Achse spielen, sind Folgestudien notwendig, die ggf. unsere Ergebnisse mit zentralem Probematerial replizieren können.
In unserer Studie konnten entsprechend auch keine signifikanten Unterschiede in den Leptin-‐Plasma-‐Werten zwischen den einzelnen Kohorten festgestellt werden, es zeigte sich lediglich ein Trend hin zu abnehmenden Werten im Verlauf des Entzugs.
Die mangelnde Signifikanz könnte dabei auch auf die kleine Anzahl an Versuchstieren in den jeweiligen Gruppen zurückzuführen sein, die aus maximal 10 Tieren bestanden, deren Anzahl durch vereinzelte Todesfälle teils noch geringer ausfiel. Bedingt durch den Pilotcharakter dieser Studie beschränkten wir uns jedoch aus ethischen Gründen auf diese Anzahl.
Auch könnte die Dosis von α-‐MSH und β-‐Endorphin, die wir zur Behandlung der Tiere wählten, zu gering und / oder in zu geringer Frequenz verabreicht worden seien, um einen signifikanten Effekt zu bewirken. Darüber hinaus kann in Anbetracht der zentralen Wirksamkeit und Regulation der untersuchten Hormone eine zu geringe Liquorgängigkeit infolge der intraperitonealen Applikationsform nicht ausgeschlossen werden. Am Tiermodell ist eine zentrale Wirkung auf den Hungerstoffwechsel über MC4-‐
Rezeptoren auch bei peripherer intraperitonealer Gabe von unselektiven Melanokortin-‐
Rezeptor-‐Agonisten belegt [119]. Eine intracerebroventrikuläre Applikation ist hingegen zur Behandlung von Patienten im klinischen Alltag aufgrund der Invasivität kaum interessant und wäre daher am ehesten von akademischem Interesse, was jedoch für eine intraperitoneale Injektion ebenso gilt. Klinisch verwendbar wäre hingegen beispielsweise eine intranasale Gabe. Bei dieser Applikationsform deutete sich in einer vorhergehenden Studie am Menschen auch eine zentrale Wirksamkeit in der Regulation des Energiehaushaltes an [113].
23
Weitere bekannte epigenetische Regulationsmechanismen neben der DNA-‐Methylierung wie Histonmodifikation oder nicht-‐codierende RNA wurden in unserer Studie nicht berücksichtigt und könnten ebenfalls an der Regulation der Leptin-‐Expression beteiligt sein. Selbstverständlich ist auch eine Beeinflussung durch uns bis dato nicht bekannte Regulationsmechanismen vorstellbar.
Studien am Menschen zum Thema Alkoholabhängigkeit leiden unter der Tatsache, dass Alkoholabhängigkeit häufig von anderen Substanzabhängigkeiten oder psychiatrischen Komorbiditäten begleitet wird [120]. Daher ist nicht auszuschließen, dass deren Ergebnisse durch Veränderungen in der epigenetischen Regulation, die durch andere Substanzen als Alkohol bedingt sind, verfälscht werden [121]. Diese Umstände erschweren es, die Effekte des Alkohols isoliert betrachten zu können. Diesem Effekt konnten wir durch Nutzung eines Tiermodells entgehen.
Ebenfalls kann durch die Nutzung eines Tiermodells ein multigenerationaler Effekt auf die DNA-‐Methylierung (wie in der Einleitung beschrieben) ausgeschlossen werden. Der Einfluss von Alkoholabhängigkeit auf den Methylierungsstatus nachfolgender direkter Abkömmlinge könnte trotzdem ein zukünftiges Forschungsthema sein.
Auch inhalatives Zigarettenrauchen und der Beigebrauch von Medikamenten könnte als Erklärung für die Unterschiede in den Ergebnissen zwischen unserer Studie und verschiedenen vorhergehenden humanen Studien dienen. Das Tiermodell bietet dabei kontrollierte und besser nachvollziehbare Bedingungen, die die Wahrscheinlichkeit, Effekte des Alkohols ohne Störfaktoren beobachten zu können, deutlich erhöhen.
In Folgearbeiten wurden und werden zukünftig weitere Hormone des oben angedeuteten Hormonnetzwerks, das im Zusammenhang mit Alkoholabhängigkeit eine Rolle spielt, untersucht, um weitere Erkenntnisse im Zusammenspiel zwischen epigenetischen Regulationsmechanismen und hormoneller Regulation bei Alkoholabhängigkeit gewinnen zu können.
Die oben ausgeführten, mittlerweile gut belegten Veränderungen des Leptin-‐Haushalts im Zusammenhang mit Alkoholgebrauch könnten Leptin als mögliche Zielgröße für Anticraving-‐Substanzen oder als Parameter zur Überwachung des Alkoholentzuges auch für den klinischen Alltag interessant machen.
24
1.3 Zusammenfassung
Alkoholabhängigkeit ist weltweit mit einer hohen Mortalität und Morbidität
verbunden. Veröffentlichungen der letzten Jahre zeigten Zusammenhänge zwischen Alkoholkonsum und der Regulation durch appetit-‐steuernde Hormone wie Leptin, das als „Sättigungshormon“ eine wesentliche Rolle im menschlichen Energiehaushalt einnimmt.
Studien zum Thema beobachteten, dass der Konsum von Alkohol beim Menschen mit ansteigenden Leptin-‐Serumspiegeln einhergeht. Diese können wiederum mit
gesteigertem Suchtverlangen und erhöhtem Rückfallrisiko in Verbindung gebracht werden.
Leptin beeinflusst dabei die Aktivität der hormonellen Hypothalamus-‐Hypophysen-‐
Nebennierenrinden-‐Achse (HPA-‐Achse), deren Derivate α-‐Melanozyten-‐
stimulierendes-‐Hormon (α-‐MSH) und β-‐Endorphin ebenfalls Gegenstand der Arbeit sind. So gaben vorhergehende Arbeiten Hinweise darauf, dass Melanocortin-‐
Rezeptor-‐Agonisten wie α-‐MSH sich günstig auf das Suchtverlangen auswirken, wohingegen Opioide mit einem erhöhten Alkoholkonsum einhergingen.
Auf neuromolekularer Ebene tragen epigenetische Regulationsmechanismen zur Pathogenese der Alkoholabhängigkeit bei. Die Epigenetik beschäftigt sich
grundsätzlich mit der strukturellen Veränderung chromosomaler Regionen und der damit einhergehenden Aktivitätsänderung. Ein wichtiger epigenetischer
Regulationsmechanismus ist die Methylierung von Cytosin.
Für verschiedene HPA-‐Achsen-‐assoziierte Gene konnte in vorhergehenden Studien ein Zusammenhang zwischen chronischem Alkoholkonsum und verändertem Methylierungsstatus der jeweiligen Promoterregion nachgewiesen werden. In einer humanen Studie zeigte sich eine umgekehrte Assoziation zwischen vermindertem Methylierungsstatus der Leptin-‐Promoter-‐Region und erhöhten Leptin-‐Serum-‐
Spiegeln einerseits und gesteigertem Suchtverlangen im Verlauf des Alkoholentzuges andererseits.
Die vorliegende Studie ist die erste Untersuchung, die die Dynamik der Leptin-‐
Promoter-‐Methylierung und der Leptin-‐Protein-‐Expression während des frühen Alkoholentzugs in einem Tiermodell für Alkoholabhängigkeit untersucht. Darüber hinaus wurde auch die Wirkung einer Behandlung mit ß-‐Endorphin oder Alpha-‐MSH auf den Methylierungsstatus der Leptin-‐Promoterregion untersucht.
Der Tierversuch wurde auf Basis des etablierten Langzeit-‐Alkohol-‐
Selbstverwaltungsmodells an Ratten durchgeführt. Sechzig Ratten erhielten über ein
25
Jahr freien Zugang zu Alkohol. Zusätzlich dienten dreißig Ratten als wassertrinkende Kontrollen. Zu verschiedenen Zeitpunkten des Alkoholentzugs wurden Proben genommen. Darüber hinaus wurde einem Teil der Tiere im Entzug entweder α-‐MSH, β-‐Endorphin oder Kochsalz-‐Lösung verabreicht und ihnen danach wieder Alkohol präsentiert.
Im Ergebnis sahen wir einen signifikant geringeren durchschnittlichen
Methylierungsstatus der Leptin-‐Promoter-‐Region bei der Alkoholgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe direkt zu Beginn des Entzuges. Im Verlauf des Entzuges zeigen unsere Daten eine Adaption der durchschnittlichen Leptin-‐Promoter-‐Methylierung an die der Kontrollgruppen. Eine signifikante Änderung der Leptin-‐Plasmaspiegel im Blut zeigte sich nicht. Interessanterweise wiesen die Tiere, die im Alkoholentzug mit α-‐MSH behandelt wurden, ähnliche durchschnittliche Leptin-‐Promoter-‐
Methylierungsraten wie die Wasser-‐trinkenden Kontrollgruppen auf, obwohl den α-‐
MSH-‐behandelten Tieren nach dem Entzug wieder Alkohol präsentiert wurde.
Unter Annahme eines funktionellen Zusammenhangs zwischen verminderter Leptin-‐
Promoter-‐Methylierung und erhöhter Leptin-‐Ausschüttung mit einhergehend gesteigertem Suchtverlangen könnten α-‐MSH oder weitere Melanocortin-‐Rezeptor-‐
Agonisten zukünftig als mögliche Therapieoption bei Patienten im Alkoholentzug in Frage kommen. Leptin hingegen könnte beispielsweise als mögliche Zielgröße zur Überwachung des Alkoholentzuges ebenfalls für den klinischen Alltag interessant sein.
35
4. Erklärung gemäß §2 Abs. 2 Nr. 7 u. 8 PromO
Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel „DNA Methylation of the Leptin Gene Promoter
is Altered by Chronic Alcohol Exposure in an Animal Model for Alcohol Dependence“ in der Klinik für Psychiatrie, Sozialpsychiatrie und Psychotherapie unter Betreuung von Prof. Dr. med. Thomas Hillemacher ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Die Gelegenheit zum vorliegenden Promotionsverfahren ist mir nicht kommerziell vermittelt worden. Insbesondere habe ich keine Organisation eingeschaltet, die gegen Entgelt Betreuerinnen und Betreuer für die Anfertigung von Dissertationen sucht oder die mir obliegenden Pflichten hinsichtlich der Prüfungsleistungen für mich ganz oder teilweise erledigt.
Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in-‐ oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe.
Die Ergebnisse der Dissertation wurden in der Fachzeitschrift “European Addiction Research” (Karger International, Basel) veröffentlicht.
Hannover, den 27.06.2020
J. Wieting
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