5.3 In Vivo-Untersuchungen mittels PIXE und LA-ICP-MS
5.3.2 LA-ICP-MS
5.3.2.3 Messung der in vivo-Proben
Die zu untersuchenden Elemente sind Mg, Zr und Y. Die weiteren Elemente wurden aufgrund des Fehlens von Referenzstandards in dieser Untersuchung nicht berücksichtigt.
In den folgenden Abbildungen sind für die Analyten die Massenanteile in Abhängigkeit der Distanz zum Steg dargestellt. Da die Werte teils außerhalb des Kalibrierbereichs lagen, wurde anhand einer extrapolierten Kalibrierung quantifiziert.
Der Stegrand wurde willkürlich aufgrund eines starken Signalanstiegs und späteren Abfalls als Zeichen des Ablationsendes als solcher angenommen, obwohl dies aufgrund der schlechten Kameraqualität nicht sicher zu gewährleisten ist. Beim Magnesium ist die Intensität gegen den Abstand zum Steg aufgetragen, da die Werte um mehrere Größenordnungen oberhalb der Kalibrierung lagen. Die Abbildungen 5.73 bis 5.75 zeigen zwei parallel zueinander zum Steg hin (D28-a) und wieder zurück (D28-b) ablatierte Messungen. Die zugehörige Probe wurde nach 28 Tagen entnommen. Es zeigen sich hier Gradienten bis zu einem Abstand von etwa 200 µm.
Bei einer der beiden Messlinien tritt für Zirkonium und Yttrium bei 500-570 µm Abstand ein lokaler Anstieg auf, der möglicherweise auf ein größeres Partikel zurückzuführen ist, das sich vom Steg gelöst hat.
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Abb. 5.73 – 5.75: Ablationssignale von 90Zr, 89Y und 25Mg bei Entnahme nach 28 Tagen; D28-a mit Ablationsbeginn im umliegenden Gewebe zum Steg hin ablatiert, D28-b parallel zu a vom Steg weg ins Gewebe ablatiert
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Beim Magnesium tritt ebenfalls ein lokales Maximum bei etwa 150 µm auf, das wie oben auf einen Partikel zurückzuführen sein könnte. Die örtliche Diskrepanz der beiden Maxima zeigt außerdem einmal mehr, dass die Seltenen Erden bzw.
Zirkonium in der Legierung lokal angereichert sind und nicht homogen mit dem Magnesium gemischt, da diese potentiellen Partikel eine andere Zusammensetzung haben.
Nach etwa 200 µm Abstand erreicht das Magnesiumsignal einen konstant niedrigen Wert, der erst bei 900 µm die Nachweisgrenze erreicht. Denkbar ist, dass an dieser Stelle ein Übergang vom dem Steg umliegenden Gewebe ins reine Einbettmaterial erfolgt, das kaum Magnesium enthält (Abb. 5.75). Die Mittelung des Gehalts nach extrapolierter Quantifizierung liefert hier einen Wert von 608 mg/kg im Bereich von 200-800 µm Abstand. Dies liegt nur geringfügig über dem Literaturwert für das Weichgewebe eines Erwachsenen von 150-250 mg/kgFrischmasse. [63]
Bei der Probe, die nach 90 Tagen entnommen wurde, zeigt sich ein relativ konstanter Gradient mit einigen kleinen Maxima bis zu einem Abstand von 1000 µm, wo der Ablationsbeginn war. Da alle Analyten qualitativ den gleichen Verlauf aufweisen, ist von einem korrosiven Abtransport durch Diffusion von der Stentoberfläche ins umliegende Gewebe auszugehen (Abb. 5.76 – 5 .78). Vom Massenanteil ausgehend ist dabei verhältnismäßig viel Zirkonium zu finden im Vergleich mit Yttrium, das im Stent einen höheren Anteil hat. Dies könnte daran liegen, dass Yttrium durch die Bildung schwerlöslicher Verbindungen wie z.B. Phosphat in unmittelbarer Umgebung des Stents immobilisiert und somit langsamer abgetragen wird. Zeitstudien nach Implantation im Knochen zeigten, dass Lanthan und Neodym zumindest im Vergleich zu Magnesium langsamer abgetragen werden. [29]
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Abb. 5.76 – 5.78: Ablationssignale des 90Zr, 89Y und 25Mg bei Entnahme nach 90 Tagen
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Nach 180 Tagen Verweildauer zeigen sich für die Analyten recht unterschiedliche Werte. So ist beim Zirkonium kein Anstieg zum Steg hin zu sehen. Es treten lediglich zwei kleine Maxima mit Gehalten bis knapp 10 mg/kg auf, spätestens nach 400 µm sind die Werte nahe oder unter der Nachweisgrenze, so dass kein verwertbares Signal mehr zu erfassen ist (Abb. 5.79). Bei Yttrium und Magnesium dagegen ist ein starker Anstieg zum Steg zu beobachten (Abb. 5.80 – 5.81), es gibt einen Gradienten mit einigen Maxima bis etwa 500 µm. Weiterhin deutet sich bei einem Abstand von 1000 µm für Yttrium ein kleines Maximum an.
Abb. 5.79 – 5.80: Ablationssignale des 90Zr und 89Y bei Entnahme nach 180 Tagen
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Abb. 5.81: Ablationssignale des 25Mg bei Entnahme nach 180 Tagen
Das Auftreten all dieser Maxima auch bei den jüngeren Proben spricht dafür, dass neben dem korrosiv diffundierenden Abbau der Analyten auch ein partikulärer Abbau des Implantats vermutlich infolge mechanischer Destabilisierung erfolgt, wobei diese Partikel vom Steg abtransportiert werden und weiter korrodieren. Diese Beobachtung wurde auch schon bei der PIXE im vorangegangenen Abschnitt gemacht. Die bei Explantation nach 180 Tagen im Vergleich zu 90 Tagen geringen Intensitäten vor allem beim Magnesium sind evtl. darauf zurückzuführen, dass über dem relevanten Gewebe noch eine etwas dickere Schicht des Einbettmaterials vorhanden war. Das schlechtere Verhältnis von Gewebe zu Einbettmaterial aufgrund der von den Lasereinstellungen abhängigen Eindringtiefe des Laserstrahls führt dann zu geringeren Intensitäten der Analyten, da diese nur im Gewebe enthalten sind.
Alternativ ist wie bereits oben erwähnt denkbar, dass das Magnesium relativ schnell abgetragen und durch Calcium substituiert wird, während die Seltenen Erden zunächst immobilisiert und langsamer abgetragen werden (vgl. Knochenstudie [29]).
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6 Diskussion und Ausblick
Ziel der Untersuchungen in dieser Arbeit war es, den Einfluss diverser Parameter (Medien, Umgebungsbedingungen, Oberflächenbehandlungen) auf den Korrosionsverlauf und die Produktbildung einer ausgewählten Magnesiumlegierung mit Seltenerdzusatz im Vergleich mit Reinmagnesium und der Standardlegierung WE43 zu charakterisieren, um letztlich ein für den Einsatz als Implantat geeignetes Material herzustellen. Die Auswahl der Legierung erfolgte dabei anhand ihrer mechanischen und teils toxikologischen Eigenschaften. In den Experimenten in vitro wurden diverse Korrosionsbedingungen variiert, um möglichst große Vergleichbarkeit zum lebenden Modell zu erreichen. Neben weiteren methodischen Untersuchungen, u.a. zur Zusammensetzung des Ausgangsmaterials, sollte außerdem gezeigt werden, ob und mit welchen Grenzen ein Abbau im lebenden Modell nachvollzogen werden kann.
Die Korrosionsexperimente in vitro haben gezeigt, dass die Wahl des Mediums entscheidenden Einfluss sowohl auf die Korrosionsgeschwindigkeit als auch auf die Produktbildung hat. Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) hat sich dabei als ungeeignet für Korrosionsversuche dieser Art (Simulation physiologischer Bedingungen) herausgestellt, da weitere Faktoren, die korrosionshemmend wirken können, durch die starke Korrosion in diesem Medium nicht zur Entfaltung kommen können. In Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) trägt die langsamere Korrosion nicht nur dazu bei, dass sich eine Oberflächenbehandlung bei der Geschwindigkeit bemerkbar macht, sondern fördert auch im Zusammenhang mit einem eingestellten CO2-Partialdruck von 5% eine differenzierte Produktbildung (mehr Carbonat neben Hydroxid) im Vergleich zu atmosphärischem CO2 -Partialdruck. Dies ist durch den höheren Carbonatanteil in DMEM gegenüber HBSS und eine mögliche Absorption von CO2 im alkalischen Milieu zu erklären.
Der Zusatz von fetalem Kälberserum führt in beiden Medien visuell erkennbar zu einer Hemmung der Korrosion, was sich an den Gehalten in Lösung aufgrund Bildung schwerlöslicher Verbindungen allerdings nicht widerspiegelt. Die Auflösung und Quantifizierung der Korrosionsrückstände hat gezeigt, dass nahezu alles eingesetzte Material bei der Korrosion in diesen schwerlöslichen Verbindungen präzipitiert wird.
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Es konnten außerdem sowohl auf mit Serumzusatz als auch serumfrei inkubierten Proben organische Verbindungen mittels XPS nachgewiesen werden. Eine Übersicht der je nach Technik gefundenen Produkte liefert Tabelle 6.1.
Tab. 6.1: Übersicht über identifizierte Verbindungen nach Methode geordnet Technik Verbindung
XRD Mg(OH)2
MgCO3 bevorzugt in DMEM aufgrund des 10x höheren Gehalts gegenüber HBSS
FT-IR OH -CO3
2-PO43- keine eindeutige Identifizierung, durch weitere breite Banden überlagert
Mg-O
Ln-O aus Ln2O3, keine eindeutige Identifizierung durch Überlagerung breiter Banden im relevanten Bereich
XPS Mg(OH)2
Die Zusammensetzung des Materials erwies sich in den Experimenten als sekundär, dem Medium kam die größte Rolle zu. Dennoch ist folgende Rangfolge bei der Korrosionsbeständigkeit des Materials, das keine mechanische oder thermische Nachbehandlung erfahren hat, festzustellen: Reinmagnesium > E11 > WE43. Diese Beständigkeit kann durch weitere Behandlungen des Materials zielführend verbessert werden.
Es wurde außerdem festgestellt, dass für präzise und richtige Ergebnisse mit der ICP-OES, insbesondere bei langem Betrieb, eine Driftkorrektur notwendig ist, da bei den meisten untersuchten Emissionslinien teils erhebliche Driften festgestellt wurden.
Welche Linien von dieser Drift betroffen sind, muss empirisch festgestellt werden. Zur Korrektur eignet sich das Eingabelungsverfahren. Das Mischungsverhältnis zu Magnesium der für diese Untersuchung gemessen Seltenen Erden spielte dabei keine Rolle.
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Anhand von Abbranduntersuchungen wurde gezeigt, dass insbesondere bei Zusatz von Zirkonium, aber auch bei Magnesium und den Seltenen Erden die Sollgehalte nicht ganz einfach einzuhalten sind. Dichteunterschiede in der Schmelze zwischen gebildeten Oxiden und auch den nicht vollständig mischbaren Metallen führten offenbar zu An- bzw. Abreicherung der Analyten in bestimmten Zonen. Beim Zirkonium führte dies zu massiven Verlusten bis zu fast 80%, da es sehr schlecht mit Magnesium mischbar und daher dichtebedingt ein Absinken zu erwarten ist.
Die Untersuchungen der Gewebeschnitte von Stents aus in vivo-Experimenten mittels PIXE zeigen eine homogene Verteilung der Legierungselemente in den Stegen der Stents an. In der Korrosionszone am Rand dieser Stege wurde eine Anreicherung von Calcium, Phosphor und Kalium beobachtet, die auf die Bildung schwerlöslicher Verbindungen wie z.B. Calciumphosphat in diesem Bereich hindeutet. Außerdem sind im Gewebe nahe der Stege teils starke lokale Anreicherungen der Seltenen Erden festgestellt worden, die einen zum Teil partikulären Abtrag des Materials zeigen.
Letzteres wurde ebenfalls mittels LA-ICP-MS festgestellt. Linienscans vom Gewebe zum Stent hin zeigen Gradienten, die durch Diffusion gelöster Analyten zustande kommen, und zusätzlich örtliche Maxima aufgrund des Partikelabtrags. Ein Vergleich mit Knochenstudien deutet darauf hin, dass Yttrium wie vermutlich auch die weiteren Seltenen Erden in unmittelbarer Umgebung des Implantats immobilisiert und somit langsamer abtransportiert wird als Magnesium und Zirkonium.
Die Ergebnisse der LA-ICP-MS können dabei perspektivisch noch deutlich verbessert werden, da durch Optimierung der Lasereinstellungen vermutlich bessere Nachweisgrenzen möglich sind. Diese lagen unter den gewählten Bedingungen für Magnesium, Yttrium und Zirkonium bei etwa 2 mg/kg und somit trotz Verbesserungsspielraum deutlich unter den Nachweisgrenzen der PIXE, die unter den gewählten Bedingungen noch etwa 50 mg/kg Seltene Erden nachweisen kann.
Die Untersuchungen mittels LA-ICP-MS konzentrierten sich in dieser Arbeit auf die Analyten Magnesium, Yttrium und Zirkonium, da diese Elemente in Form eines zertifizierten Ölstandards zur Verfügung standen und so den zur Quantifizierung als Referenz dienenden, synthetisierten Lackstandards zugesetzt wurden. Die weiteren in den untersuchten Legierungen enthaltenen Elemente wie z.B. Neodym könnten
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den Lackstandards durch Zusatz anderer organischer Flüssigstandards beigemischt werden, um auch hier quantitativ messen zu können. Voraussetzung dafür ist, dass sich der Lack und die verwendete Standardlösung homogen mischen lassen.
Alternativ ist zumindest eine nicht-quantitative Messung sinnvoll, um einen Gradienten aufzuzeigen und qualitativ vergleichen zu können, ob hier ebenfalls ein sowohl partikulärer als auch diffusiver Abbau des Implantats nachzuweisen ist.
Zur Validierung der Vergleichbarkeit zwischen Lackstandards und eingebetteten Proben wäre eine Kontrolle der Standards mithilfe von zertifiziertem Referenzmaterial wünschenswert, das nicht zur Verfügung stand. Weiterhin ist auch die Vergleichbarkeit zwischen Experimenten in vitro und in vivo verbesserungsfähig, z.B.
durch dynamische Korrosionsbedingungen in einem Kreislaufsystem.
Bezüglich des Probensystems sind andere Legierungsbestandteile aufgrund besserer Biokompatibilität von Interesse und wie sich zusätzliche mechanische oder Temperaturbehandlungen auf die Korrosionseigenschaften auswirken. Weiterer Spielraum bietet sich durch das Auftragen von Beschichtungen.
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