Matrix ‚EK unfiltriert‘ (LF 4)

DISKUSSION Bakterien keine Mechanismen besitzen, um der Opsonierung und Lyse durch das Komplement zu entgehen, kann an dieser Stelle vermutet werden, dass eine gewisse Restaktivität dieses Abwehrmechanismus vorhanden war, das die Mikroorganismen in unterschiedlichem Maß geschädigt haben könnte.

Li hat experimentell belegt, dass die Produktion der Yops, die die Invasion phagozytierende Zellen vermitteln, erst bei höheren Temperaturen angeschaltet (32°C) wird. Eine Aktivierung bei Raumtemperatur und eine durch Konformitätsänderung der äußeren Zellmembran resultierende Verbesserung der Adhäsion scheint deshalb nicht denkbar [25, 49, 213, 214].

Ob die verstärkte Anlagerung der plasmidhaltigen Bakterienzellen an die Filtermembranen durch YadA oder Inv induziert wurde oder andere Serovare von Yersinia ein verändertes Filtrationsverhalten zeigen, müsste mit weiteren Experimenten geklärt werden.

der hohen Albuminkonzentration erklärt [105]. Auch Druckänderung oder die Bildung von Luftbläschen kann die Filtrationsleistung herabsetzen [173]. Möglicherweise kann auch ein nicht einheitliches Handling im Filtrationsexperiment zu unterschiedlichen Ergebnissen geführt haben.

Bis auf die Beutel 5 und 8 wurde eine Abnahme der Keimzahlen nach Inkubationszeit festgestellt. Ob die Temperatur einen Einfluss auf die Entwicklung von Yersinia enterocolitica hatte (möglicherweise zusammen mit dem individuellen Spenderblut), kann mit den bisherigen Erkenntnissen nicht erklärt werden. Hier könnte das Komplement, das noch im EK vorhanden gewesen sein sollte, einen Einfluss auf die gesunkenen Keimzahlen gehabt haben. Da die EKs alle von unterschiedlichen Spendern stammten, besteht auch die Möglichkeit, dass andere spenderspezifische Eigenschaften wie Antikörper gegen Yersinia oder Leukozyten zur Reduktion der Keimzahlen in 6 Beuteln geführt haben.

Insgesamt zeigt die LF mit dem Feuchtfilter ein sehr gutes Ergebnis, sowohl mit PAGGS-M als auch mit EK.

Eine Verbesserung der Retention von Bakterien durch phagozytierende Zellen des Blutes konnte in diesem Versuch nicht festgestellt werden, wodurch die Hypothesen von Högman nicht unterstützt wird [174]. Die Bakterienzelloberfläche scheint adhäsive Eigenschaften zu besitzen, die Yersinia enterocolitica im Filter zurück halten. Auch in der Matrix EKf, in der durch das Alter der Komponenten keine Leukozyten mehr erwartet wurden, konnte ein gutes Filtrationsergebnis mit dem Trockenfilter erreicht werden.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Anteil an großen Kolonien von Stamm PEI-A-101-02 weniger als 10% beträgt. Diese nachweislich plasmidnegativen Kolonien wurden im Trockenfilter mit NaCl und ‚EK filtriert‘ schlechter zurückgehalten als die Population, die die kleinen plasmidhaltigen Kolonien bildeten. Dem Plasmid ist zumindest mittelbar eine verstärkte Wechselwirkung mit dem Filter durch die pathogenen Oberflächenstrukturen zuzuschreiben. Die einzige Ausnahme bildet die Matrix PAGGS-M. Hier waren vor Filtration 10% der Bakterien plasmidlos, danach war der Anteil der großen Kolonien mit 31%, 8%, 9% und 27% in den vier Beuteln recht unterschiedlich, was aber an den niedrigen Keimzahlen im Filtrat gelegen haben kann, die das Ergebnis ungünstig beeinflusst haben könnten.

In der Literatur wird beschrieben, dass die Virulenzfaktoren, die auf der Oberfläche von Enterobacteriaceae exprimiert werden, die Adhäsion und Invasion unterstützen [154]. Diese Eigenschaften könnten sich auch auf das Filtermaterial auswirken und die starke Rückhaltung der Bakterien mit Plasmid erklären. Um diese Hypothese zu stützen, müssten weitere Filtrations-Versuche mit apathogenen Stämmen durchgeführt werden, um festzustellen, ob sich hier das Retentionsverhalten ändert.

DISKUSSION Weiterhin ist zu vermuten, dass auch die Matrix eine Rolle spielt, da der plasmidlose Stamm PEI-A-102 in NaCl schlechter vom Filter adsorbiert wurde als in EKf ohne Inkubation. Gong stellte fest, dass unterschiedliche Serotypen von Yersinia enterocolitica in unterschiedlichen Matrizes (TSB, Plasma, PBS) eine variable Retention durch das Filtermaterial zeigen [143]. Aber auch bei unterschiedlichen Spezies war das Filtrationsverhalten im Vergleich sehr divergent [216].

Beide Filterarten (Trocken- und Feuchtfilter) trugen zu einer starken Abreicherung von Yersinia enterocolitica PEI-A-101-02 bei, reichten aber nicht aus, um alle inokulierten Bakterien aus dem Blut zu eliminieren. Hierbei schnitt der Feuchtfilter von Macopharma mit maximalen Retentionsraten von 99,8%

besser ab als der Trockenfilter, der in der Matrix EKf ohne Inkubationszeit nur im Mittel 89% Retention erreichte. Da die Benetzungsfähigkeit für die optimale Filtration entscheidend ist, wird vermutet, dass der vorher angefeuchtete Filter von Beginn an optimale Eigenschaften zur Retention von Zellen besitzt.

Adäquate Benetzung des Filtermaterials ist substantiell, um einen optimalen Kontakt mit den Blutzellen zu erreichen [158, 217]. Heutzutage werden Inline-Filtersysteme (von beiden Herstellern) zur Herstellung von leukozytendepletierten Blutkomponenten mit der bereits integrierten Lagerlösung verwendet, die vor Beginn der Filtration zur Befeuchtung des Filter eingesetzt wird. Das hier verwendete trockene Filtermaterial von Fresenius Kabi wurde durch das EKf erst angefeuchtet und so war möglicherweise zu Beginn des Versuches die Filtrationsleistung eingeschränkt. Bis auf die Retentionsraten in den Beuteln 5 bis 8 im LD-Versuch Nr.4 (Feuchtfilter mit ‚EK unfiltriert‘), bei dem die Filter nach Inkubation nicht gewechselt wurden und möglicherweise dadurch eine etwas schlechtere Adhäsion zeigten, lag die Resorption bei nahezu 100%. Insgesamt wurden die YEP+-Bakterien vom befeuchteten Filtermaterial besser adsorbiert als vom Trockenfilter, sowohl in nicht zellhaltiger (NaCl vs. PAGGS-M), als auch in zellhaltiger Matrix (EK vs. EKf).

Aus mikrobiologischer Sicht ist eine Leukozytenfiltration von hergestellten EKs zu befürworten, da pathogene Vertreter von Yersinia enterocolitica, die sich im Blut des Spenders befinden, durch dieses Verfahren, zumindest zum größten Teil eliminiert werden können und so das Risiko für einen Transfusionszwischenfall sinken kann.

4.5 WACHSTUM VON YERSINIA ENTEROCOLITICA IM BLUT

Bakterien sind aber in der Lage, im Spenderblut zu überleben, da sie in zwei hergestellten EK-Komponenten wiedergefunden wurden. Die plasmidhaltigen Yersinia-Zellen des Stammes PEI-A-101-02 überstanden die Inkubation in Vollblut über Nacht. Der plasmidlose inokulierte Stamm konnte weder im Vollblut noch später in den hergestellten Komponenten wiedergefunden werden. Dies lässt den Schluss zu, dass es den plasmidlosen Zellen nicht möglich war, sich gegen die humorale Immunantwort zu etablieren.

In verschiedenen Publikationen wird das vorübergehende „Verschwinden“ von Yersinia enterocolitica im Vollblut beschrieben. Nach einer lag-Phase, deren Dauer von der Anzahl der inokulierten Bakterien und der Temperatur abhängt, konnte Yersinia enterocolitica aus dem Blut isoliert werden [96, 174]. Hierzu wurden Ergebnisse veröffentlicht, die zeigen, dass das Wachstum bestmöglichst gehemmt wird, wenn das Blut vor Lagerung bei 4°C für einige Stunden bei einer Temperatur von 20°C inkubiert wird. Das Bakterium muss sich an die veränderte Umgebung anpassen und den bakteriziden Effekt des Plasmas überleben [85, 96].

Wie das plasmidhaltige Bakterium im Spenderblut überlebt und in die EK Komponente gelangt, bleibt allerdings unklar. Möglicherweise überleben einige Bakterien im Blut und können sich gegen Komplement und Phagozyten behaupten, lagern sich an Blutzellen an oder dringen in die Zellen ein und überleben dort.

Die Produktion und der Einbau von YadA (Komplementinaktivator) könnten durch die Interaktion mit Blutzellen und Plasmaproteinen bei plasmidhaltigen Bakterienzellen bei RT getriggert werden und auf diesem Wege evtl. nicht temperaturabhängig bei 37°C verlaufen. Die Temperatur spielt für die Vermehrung aber offenbar bei der Lagerung des Vollbluts eine Rolle, da das Wachstum von Yersinia enterocolitica bei 20°C im Vergleich zur 4°C und 37°C bestmöglich gehemmt wird [96]. Im Gegensatz zum VB wurde Wachstum plasmidhaltiger Yersinien bei RT und auch bei 4°C in GFP, hauptsächlich in abgelaufenen EKs bei 4°C und teilweise auch in abgelaufenen TKs bei RT nachgewiesen (eigene Ergebnisse s. 3.5 und [85]).

Eine Übersicht über die Wachstumsversuche in den verschiedenen Blutkomponenten gibt Tabelle 4-2.

DISKUSSION

TABELLE 4-2: ÜBERSICHT ÜBER DIE WACHSTUMSVERSUCHE IN DEN BLUTKOMPONENTEN MIT BEIDEN STÄMMEN VON YERSINIA ENTEROCOLITICA

Wachstum über 14 Tage PEI-A-101 PEI-A-102

EKf am Ende der Lagerzeit (Kapitel 3.5.1

Wachstum, auch bei geringen Inokula von 0,03 KBE/ml EK

Wachstum bei Inokula von 3,7 KBE/ml EK bis 48 KBE/ml EK

TKf am Ende der Lagerzeit (Kapitel 3.5.3

Nur bei Inokula ab 77 KBE/ml TK Kein Wachstum

Gefrorenes Frischplasma (Kapitel 4.5.3)

Wachstum bei 4°C in einem von 4 gepoolten Plasmen in beiden Ansätzen der Doppelbestimmung, bei RT nur in einem Ansatz desselben

Plasmas

Inokulum 100 KBE/ml GFP

Kein Wachstum

EK

(Kapitel 3.8.2 )

Wachstum in 2 von 6 EK-Komponenten mit einem sehr geringen Inokulum von 20 KBE/ml

VB

Kein Wachstum

Vollblut

(Kapitel 3.7 und 3.8

Kein Wachstumsversuch, aber starke Reduktion der Keimzahlen innerhalb

von wenigen Stunden

EKf=leukozytendepletiertes Erythrozytenkonzentrat (am Ende der Lagerzeit),

TKf=leukozytendepletiertes Thrombozytenkonzentrat (am Ende der Lagerzeit), EK=unfiltriertes Erythrozytenkonzentrat (innerhalb der Lagerzeit)