2.3 Statistik
3.1.4 Lebendzellzahl der Mikroglia
Die Konzentrationen der TLR-Agonisten, die in dieser Studie verwendet wurden, wiesen entgegen bisher veröffentlichter Daten keine Toxizität für Mikroglia auf. Stimulation von Mikroglia mit den höchsten Dosen an TLR-1/2-, -3-, -4- und -9-Agonisten resultierte nicht in einem verminderten Überleben dieser Zellen. Dies zeigte sich im Vergleich aller stimulierten und unstimulierten Gruppen.
Abbildung 9 Lebendzellzahl Vitamin-D-suffizienter und Vitamin-D-defizienter Mikroglia
Graue Balken stellten Vitamin-D-reiche, schwarze Balken Vitamin-D-arme Gruppen nach Stimulation mit Pam3CSK4 1 µg/ml, Poly(I:C) 10 µg/ml, LPS 1 µg/ml und CPG 10 µg/ml (n = 4) dar. Zu Anfang steht jeweils die Kontrollgruppe (Medium) (Abbildung aus Publikation dieser Arbeit).
In Abbildung 9 (Seite 43) sind die Ergebnisse nach Behandlung mit Pam3CSK4 1 µg/ml, Poly(I:C) 10 µg/ml, LPS 1 µg/ml und CPG 10 µg/ml (n = 4) durch Median und Standardfehler graphisch dargestellt. Die Daten wurden mittels one-way ANOVA analysiert
und nach Bonferroni für multiples Testen korrigiert. Es konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Tabelle 5 (Seite 44) stellt die einzelnen Ergebnisse in Zahlen dar.
Stimulanz Vitamin- D-suffizient Vitamin- D-defizient
Medium 100 ± 7,5%, 100 ± 1,5%;
Pam3CSK4 1 µg/ml 100,8 ± 1,9%, 99,5 ± 1,9%;
Poly(I:C) 10 µg/ml 101,7 ± 2,4%, 103,8 ± 3,2%;
LPS 1 µg/ml 97,7 ± 5,4%, 102,1 ± 6,4%;
CPG 10 µg/ml 102,3 ± 2,6%, 101,7 ± 3,1%.
Tabelle 5 Überlebensrate der Mikrogliazellen nach Stimulation
(Angabe in Median und Standardfehler, Abbildung aus Publikation dieser Arbeit).
4 Diskussion
Ausgangspunkte unserer Studie waren folgende Aspekte: die Induktion einer bakteriellen Meningitis durch E. coli unter Verwendung Vitamin-D-armer und –normalhaltiger Mikrogliazellen und deren Reaktion hinsichtlich Phagozytoserate, Zyto- und Chemokinausschüttung sowie NO-Freisetzung nach Stimulation mit TLR-Agonisten. Wir entschlossen uns, in dieser Studie das lebende gramnegative Bakterium E. coli zur verwenden, da auch bereits in der Vergangenheit eine Aktivierung der Mikroglia durch E.
coli bestätigt werden konnte (Ribes et al. 2010). Die retrospektive Studie von Hoogland und Kollegen untersuchte Tierexperimente, durchgeführt von 1950 bis 2013, hinsichtlich der Reaktion von Mikrogliazellen bei entzündlichen Prozessen des Gehirns. Auch hier zeigte sich, dass lebende E. coli-Bakterien nach zwei Tagen, hitzegetötete Bakterien hingegen nach zwei Wochen zu einer Mikrogliaaktivierung führten (Hoogland et al. 2015). Ebenso wie das verwendete Bakterium stellt das Alter der Zellen einen wichtigen Faktor dar.
Inzidenz und Mortalität einer bakteriellen Meningitis waren im Alter im Vergleich zu jüngeren Erwachsenen stark erhöht. Mikrogliazellen und Peritonealmakrophagen gealterter Mäuse phagozytierten weniger E. coli und setzten weniger NO, Zyto- und Chemokine frei als Zellen junger Mäuse. Dieses Ergebnis ließ sich sowohl ohne Aktivierung als auch nach Stimulation mit TLR-2-, -4- und -9-Agonisten reproduzieren (Schütze et al. 2014). Das Ausmaß der Mikrogliaaktivierung bei einer systemischen entzündlichen Reaktion wird somit maßgeblich durch das Alter bestimmt (Hoogland 2015). So weist zum Beispiel Mikroglia des gealterten Gehirns eine höhere Expression proinflammatorischer Zytokine auf. Diese Veränderung führt zu einer verlängerten und verstärkten Immunantwort (Norden und Godbout 2013). In unserer Studie wurden Mikrogliazellen verwendet, die aus neugeborenen Mäusen gewonnen wurden. Die Gewinnung der Peritonealmakrophagen erfolgte aus den Elterntieren, welche einige Monate alt waren. Somit stehen die verwendeten Zellkulturen nicht unter dem Einfluss des Alters, sondern des Fehlens oder Vorhandenseins von Vitamin D. Um einen manifesten Vitamin-D-Mangel herbeizuführen, wurde die Ernährung der Mäuse in unserer Studie, wie oben beschrieben, mit Vitamin-D-armem und –normalhaltigem Futter durchgeführt. So konnten entsprechende Vergleichs-gruppen (Vitamin-D-suffizient, Vitamin-D-defizient) geschaffen werden, welche sich aufgrund der Ernährung nachweislich signifikant in ihrem Vitamin-D-Spiegel im Serum unterschieden. Die Serumkonzentration der biologisch aktiven Form des Vitamin D, 1,25(OH)2, wird hauptsächlich über die endokrine Regulation der 1α-Hydroxylase bestimmt
und wird nur bedarfsgerecht vom Körper synthetisiert. Einen direkten Rückschluss auf den Vitamin-D-Status erlaubt die Serumkonzentration des im Blut zirkulierenden Spiegels von 25(OH)D3, welcher insbesondere von Sonnenexposition und Ernährungszustand abhängig ist (Hewison 2012). Auch beim Menschen ist eine zu geringe Vitamin-D-Aufnahme mit der Nahrung ein Grund für einen manifesten Vitamin-D-Mangel. Dieser lässt sich ebenfalls laborchemisch mit hoher Sensitivität über den 25-Hydroxyvitamin-D-Serumspiegel nachweisen (Holick 2007). Die Ursache des Vitamin-D-Mangels ist hierdurch jedoch nicht bewiesen. So kann nicht nur eine mangelhafte Ernährung, sondern auch ungenügende UV-Exposition ursächlich für eine verminderte Vitamin-D-Produktion sein. In unserer Studie wurden die Versuchstiere in gleichem Maße Ultraviolettstrahlung ausgesetzt. Physiologisch kommt es im Rahmen der Immunantwort zur Stimulation von Mikrogliazellen durch TLR.
Die Stimulation einer aktiven Immunantwort mit TLR-Agonisten stellt eine gängige und nachweislich valide Methode in der Untersuchung von verschiedenen pathophysiologischen Vorgängen dar (Ebert et al. 2005). Insbesondere für LPS konnte eine erhöhte Aktivierung der Mikroglia nachgewiesen werden (Hoogland et al. 2015). Diese Methode wurde erstmals 1985 durch Isberg und Falkow an einer Zellkultur durchgeführt (Isberg und Falkow 1985).
Damals wurden die phagozytierten Bakterien im Mikroskop gezählt. Ein Jahrzehnt später wurde die gleiche Methode mit primären Makrophagen durchgeführt und die Bakterien durch quantitatives Ausplattieren bestimmt (Segura et al. 1998). 2009 führten Ribes et al.
diese Methode bei primären Mikrogliazellen ein. Bisher nahm man an, dass die Verwendung hoher Dosen von TLR-Agonisten zu einem vermehrten Zelluntergang führt.
Ebert und Kollegen zeigten, dass -entgegen diesen Kenntnissen- aus Mäusen gewonnene Mikrogliazellen auch hohe Dosen der Stimulantien überleben können (Ebert et al. 2008).
Auch in unserer Studie war die Überlebensrate der Mikrogliazellen nach Stimulation mit hohen Dosen an TLR-1/2-, -3-, -4- und -9-Agonisten nicht beeinträchtigt. Durch die in unserem Modell verwendeten Vitamin-D-defizienten Mikrogliazellen war es ebenso möglich, eine antibakterielle Aktivität von Vitamin D in physiologischen Konzentrationen nachzuweisen. Im Rahmen der Vitamin-D-Defizienz waren die Phagozytoserate und die intrazelluläre Abtötung von E. coli gleichbleibend oder teilweise sogar erniedrigt. Die Abtötungsrate des Bakteriums in Vitamin-D-defizienten Zellen erhöhte sich nachdem die Zellen mit TLR-1/2-, -3-, -4- und -9-Agonisten stimuliert wurden. Wir konnten zeigen, dass bei Vorliegen eines Vitamin-D-Mangels und trotz Stimulation mit hohen Dosen von TLR-1/2-, -3-, -4- und -9-Agonisten, die Fähigkeit der Mikrogliazellen reduziert ist, den Erreger zu phagozytieren und intrazellulär abzutöten. Für TLR-1/2-Agonisten und niedrigere
Konzentrationen der TLR-3-, -4- und -9-Agonisten war der Effekt des Vitamin D milde und die Unterschiede in der Phagozytoserate zwischen Vitamin-D-defizienten und -suffizienten Mikrogliazellen nach statistischer Korrektur für wiederholtes Testen individueller Konzentrationen nicht signifikant. Der Effekt war also abhängig von der Konzentration der Stimulantien. In vergangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass bereits aktivierte Mikroglia das angeborene Immunsystem auf verschiedene Weise beeinflussen können.
Auch wenn der genaue Mechanismus auf molekularer Ebene noch nicht abschließend erforscht ist, stellt sich heraus, dass Mikroglia sowohl neuroprotektiv als auch neurotoxisch wirken können (Hanisch und Kettenmann 2007). So erhöhte die Stimulation von Mikrogliazellen aus Mäusen mit TLR-1/2-, -3-, -4- und -9 Agonisten oder endogenen Liganden wie Fibronektin für TLR-4, die bakterielle Phagozytose und die intrazelluläre Tötung von Bakterien (Ribes et al. 2009; Ribes et al. 210; Ebert et al. 2005). Ein weiteres Beispiel für die Schlüsselfunktion der TLR im Rahmen der Immunabwehr des ZNS stellt die verstärkte Expression der TLR mRNA für TLR-2, -4 und -7 in Gehirnen junger C57BL/6-Mäuse bei der E. coli-Meningitis dar (Böttcher et al. 2003). Die Phagozytose hängt entscheidend vom TLR-Signalweg ab (Yates und Russell 2005). In Abwesenheit von TLR verschlechterte sich dementsprechend die Phagozytoserate von Bakterien in Phagosomen (Blander und Mezhitov 2004). Passend zu diesen Beobachtungen konnten auch wir in dieser Arbeit bestätigen, dass die Stimulation mit TLR-Agonisten zu einer erhöhten Phagozytoserate führte. Zuvor konnten Redlich et al. ebenso zeigen, dass die Stimulation von Mikrogliazellen mit TLR-Agonisten-1/2, -3, -4 und -9 die Phagozytose von Cryptococcus neoformans erhöhte (Redlich et al. 2013). Sind Bakterien einmal in Phagolysosomen eingeschlossen und reaktiven Sauerstoffspezies oder anderen bakteriotoxischen Komponenten ausgesetzt, unterliegen sie der bakteriellen Lyse. Ebert et al. zeigten, dass die Stimulation der Mikroglia mit TLR-Agonisten dosisabhängig ist.
Außerdem ist eine effiziente Phagozytoserate reaktiver Mikrogliazellen nicht nur von der Menge aufgenommener Bakterien abhängig, sondern auch von ihrer Fähigkeit, phagozytotische Signale zu modulieren (Ebert et al. 2005). In unserer Arbeit konnte ebenfalls ein dosisabhängiger stimulierender Effekt auf die Phagozytose nachgewiesen werden. Weiterhin untersuchten wir die NO-Freisetzung in Vitamin-D-defizienten und – suffizienten Mikrogliazellen nach Stimulation mit TLR-Agonisten. In unserer Studie konnte kein Unterschied zwischen Vitamin-D-defizienten und -suffizienten Mikrogliazellen in Bezug auf die NO-Freisetzung, nachdem diese Zellen mit hohen Konzentrationen von TLR-Agonisten stimuliert wurden, festgestellt werden. In vorangehenden Studien konnte gezeigt
werden, dass Mikrogliazellen auf bakterielle und endogene Stimulantien mit der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine und Stickoxid-Radikale (NO) reagierten (Iliev et al. 2004; Ebert et al. 2005; Lotz et al. 2005). Diese Erkenntnis stützt sich auf das Ergebnis einer Studie von Garcion et al.. Der aktive Metabolit 1,25(OH)2D unterdrückte in neuronalen Zellen das zur NO-Erzeugung notwendige Enzym Sticksoffmonoxid-Synthase (iNOS) (Garcion et al. 1997). Auch Hur et al. konnten nachweisen, dass Vitamin-D die NO-Freisetzung aktivierter Mikroglia hemmt und somit wahrscheinlich den potentiell neurotoxischen Effekt der Immunantwort verringert. Diese Erkenntnisse führte man auf die LPS-induzierte Hemmung der 1α-Hydroxylase und VDR zurück (Hur et al. 2014). Auch in unserer Studie wurde die Stimulation mit LPS durchgeführt, führte jedoch zu einem ausbleibenden Effekt der NO-Produktion. Wie in der Einleitung bereits dargelegt, sind Mikrogliazellen professionelle intrinsische Antigen-präsentierende Zellen im ZNS und spielen bei der Rekrutierung von Leukozyten in das Gehirn eine wichtige Rolle. Dies geschieht beispielsweise durch die Freisetzung von Zytokinen (Kettenmann et al. 2011).
Bei der Betrachtung der einzelnen Konzentrationen der Zytokinausschüttung nach Stimulation mit verschiedenen TLR-Agonisten konnten wir teilweise einen signifikanten Unterschied in der Ausschüttung zwischen Vitamin-D-suffizienter und –defizienter Mikroglia feststellen. Obwohl nicht alle einzelnen Konzentrationen einen statistisch signifikanten Unterschied zeigten, setzten die Vitamin-D-defizienten Mikroglia, mit Ausnahme von CXCL-1, generell eine kleinere Menge an Zytokinen und Chemokinen nach Stimulation mit TLR-Agonisten frei, als die Vitamin-D-suffiziente Gruppe. Somit scheint ein Vitamin-D-Mangel in unserem Modell der bakteriellen Meningitis eher einen hemmenden Einfluss auf die Immunabwehr zu nehmen. In jüngster Vergangenheit konnte in In-vitro-Studien gezeigt werden, dass aktivierte Mikroglia unter dem Einfluss von Vitamin-D die Expression von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-6, IL-12 und TNF-α reduzieren und die Expression von IL-10 erhöhen. Hierdurch könnte es zur Abschwächung der immunvermittelten Schädigung des zentralen Nervensystems kommen (Boontanart et al. 2016). Unsere Studienergebnisse lassen sich daher mit der momentanen Studienlage nur teilweise vereinbaren, da Vitamin-D-suffiziente Mikroglia höhere Mengen an Zytokinen freisetze. Das Vitamin-D könnte somit eine justierende Rolle in der Immunantwort des zentralen Nervensystems einnehmen. Um diesbezüglich eine genauere Aussage treffen zu können, müssten weitere Studien folgen, in denen oben genannte Daten reproduziert werden können. Gertig und Hanisch fassten die Vielfalt der Mikroglia zusammen. Sie hielten fest, dass eine Dysregulation der mikroglialen Zytokinproduktion auch neurotoxisch auf die
Neuronen wirken kann (Gertig und Hanisch 2014). Weiterhin zu beachten ist allerdings, dass die Reaktion der Mikroglia nach Stimulation und die daraufhin folgende Zytokin- und Chemokinausschüttung von verschiedenen Faktoren abhängt. So ist die Reaktion je nach Art des Bakteriums (grampositiv oder gramnegativ) und den herrschenden Umweltbedingungen, wie zum Beispiel reduzierte oder normale Vitamin-D-Versorgung, unterschiedlich (Häusler et al. 2002). Eine Aussage insbesondere in Hinsicht auf die Immunreaktion bei Stimulierung durch grampositive Bakterien kann in unserer Studie nicht getroffen werden. In unserer Studie wurde die Stimulation der Mikroglia mit dem gramnegativen Bakterium E. coli durchgeführt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist das möglicherweise unterschiedliche Ansprechen der Zellen auf Vitamin D in In-vitro und In-vivo Studienmodellen (Peelen et al. 2011). Die Ergebnisse unserer Studie beziehen sich ausschließlich auf In-vitro Mausmodelle. Obwohl einige Studien die epidemiologische Assoziation zwischen Vitamin-D-Mangel und infektiösen Erkrankungen gezeigt haben, kann diesbezüglich laut Kearns et al. bisher keine valide Aussage getroffen werden. Im Gegensatz zur Behandlung der Osteoporose ist daher ein möglicher therapeutischer Effekt der Behandlung mit Vitamin-D bei infektiösen Erkrankungen derzeit noch nicht abschließend belegt (Kearns et al. 2015). Laut dieser retrospektiven Studie beeinflussen Faktoren wie eine hohe Variabilität zwischen den einzelnen Studienmodellen und individuelles Ansprechen des Organismus auf Vitamin-D die Ergebnisse. Mit steigender Resistenzrate der Bakterien ist es notwendig, die Entwicklung von Strategien zur Bekämpfung bakterieller Infektionen voranzutreiben. Eine Möglichkeit bestünde daher in einer kontrollierten Vitamin-D Substitution. Denn um eine adäquate Immunreaktion des Körpers zu gewährleisten, ist nach Ergebnissen aus unserem In-vitro-Modell eine ausreichende Serumkonzentration an Vitamin D notwendig. Bisher konnte durch In-vitro-Studien belegt werden, dass Vitamin D die Barrierefunktion der Epithelzellen, zum Beispiel in Lunge oder Gastrointestinaltrakt, aufrechterhält sowie die Einwanderung von Immunzellen fördert und somit die Immunantwort adäquat regulieren kann (Schwalfenberg 2010). Vitamin D übt seine biologische Funktion aber nicht nur durch die Beeinflussung zellulärer Prozesse aus, sondern auch durch die Beeinflussung der Genexpression (Deluca et al. 2015).
5 Zusammenfassung
In dieser Arbeit ist untersucht worden, ob eine orale Vitamin-D-Supplementierung zu einer erhöhten Infektionsresistenz des Gehirns gegenüber E. coli-Infektionen in vitro führt. Im in-vitro-Modell der bakteriellen Meningitis wurde die Wirkung von Vitamin D3 auf die Phagozytoserate, intrazelluläre Abtötung von Erregern und Immunantwort der Mikrogliazellen nach Stimulation der Mikrogliazellen mit TLR-Agonisten untersucht. In Zusammenschau der Ergebnisse führt ein Mangel an Vitamin D bei Mikrogliazellen zu einer herabgesetzten Phagozytose und verminderten Abtötungsrate des Erregers. Liegt Vitamin D hingegen in ausreichender Konzentration vor, so kann vermutlich eine antibakterielle Wirkung erzielt werden. Durch Stimulation mit verschiedenen TLR-Agonisten erhöhte sich die Phagozytose und intrazelluläre Abtötung von E. coli K1 in Mikrogliazellen. Dieser Prozess kann wiederum unter Vitamin-D-defizienten Bedingungen negativ beeinflusst werden, resultierend in einer verminderten Phagozytose und intrazellulären Tötungsrate von Bakterien. Somit hängt die Immunreaktion des angeborenen Immunsystems auch von der Vitamin-D-Konzentration im Organismus ab. Hinsichtlich der NO-Freisetzung gab es in unserem In-vitro-Modell keinen signifikanten Unterschied unter Vitamin-D-suffizienten und – armen Bedingungen, sodass wir hierzu keine positive oder negative Wirkung des Vitamin D feststellen können. Der Vitamin-D-Mangel beeinflusste aber das Ausmaß der Zyto- und Chemokinfreisetzung der Mikrogliazellen während einer E. coli-Infektion. So wurden nach Stimulation mit TLR-Agonisten weniger Zyto- und Chemokine von Vitamin-D-defizienten Zellen ausgeschüttet als von suffizienten Zellen. Somit wird unter Vitamin-D-Mangel die Effektivität der erworbenen Immunreaktion des zentralen Nervensystems gesenkt und die Chemokinausschüttung während einer Entzündungsreaktion beeinflusst. In unseren in-vitro Untersuchungen wurde erstmals demonstriert, dass Vitamin-D-Mangel die Fähigkeit der Mikrogliazellen des Gehirns reduziert, Bakterien zu phagozytieren und intrazellulär abzutöten. Somit konnte sie die ungünstige Rolle von Vitamin-D-Mangel bei Infektionen des ZNS durch den gramnegativen Erreger E. coli gezeigt werden.
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