¾ CO2-Inkubator Fa. Heraeus® KendroLab. Prod. GmbH, Hanau,D
¾ Lichtmikroskop Axioskop 2 plus // Axiovert 200 Fa. Carl Zeiss Mikroskopie, Jena, D
¾ Digitalkamera Coolpix 990 Fa. Nikon GmbH, Düsseldorf, D
¾ Laminar-Flow-bank HERAsafe® Fa. Heraeus® KendroLab. Prod. GmbH, Hanau,D
¾ Zentrifuge ROTANTA / P Fa. A. Hettich GmbH&CoKG, Tuttlingen, D
¾ Minispin-Zentrifuge Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, D
¾ Zentrifuge für PCR-Tubes Fa. Neo Lab®, Heidelberg, D
¾ Autoclav Varioklav® Fa. H+P LabortechnikGmbH, Oberschleißheim, D
¾ Präzisionsfeinwaage, Typ 370-13 Fa. Kern Gottlieb&Sohn GmbH, Albstadt, D
¾ Vortex-Gerät Reax Control Fa. Heidolph Elektro GmbH&CoKG, Keilheim, D
¾ Speed Vac Plus Savant® Fa. Life Sciences International, Frankfurt, D
¾ Wasserbad WB/WO 7-45 Fa. Memmert GmbH & Co KG, Schwabach, D
¾ Vakuumpumpe Forschungswerkstatt, Charité-Virchow, D
¾ Hämocytometer, Neubauer Optik Fa. Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, D
¾ Hybridisierungsofen Fa. Heraeus® KendroLab. Prod. GmbH, Hanau,D
¾ Hybridisierungszylinder Fa. Biometra GmbH, Göttingen, D
¾ Thermocycler, Mastercycler Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, D
¾ Pipettierhilfe, akkubetrieben Fa. Hirschmann® Laborgeräte, Eberstadt, D
¾ Variable Pipettierhilfe Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, D
¾ Regulierbare 8-Kanal-Multipipette Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, D
¾ Quarzglas-Küvette, 105.202 QS Fa. Hellma Optik GmbH, Jena, D
¾ Spectral Photomter Gene Quant II (01-04/94) Fa. Pharmacia Biotech, Cambridge, GB
¾ Mikrotiterplatten-Enzymimmunoassayreader Fa. BIO RAD Laboratories GmbH, München, D
¾ Immuno Wash Microplatewasher (Model 1575) Fa. BIO RAD Laboratories GmbH, München, D
¾ Röntgenkassette Dupont Quanta Detail (Cronex)Fa. Du Pont Building, Bad Homburg, D
¾ Röntgenfolien Hyperfilm™ ECL™ Fa. Amersham Pharmciabiotech, (High performance chemiluminescence film) Buckinghamshire,GB
¾ Röntgenentwicklungsgerät Protec 45 compact Fa. Protect-Gerätebau GmbH, Obere Ölmühle, D
¾ Scanner Plustek, Optic Plus ST48 Fa. Plustek Technology GmbH, Norderstedt, D
¾ GEArrayAnalyzer, Version 1.3 Fa. SuperArray Bioscience Corp., Frederick, USA
¾ ACDSee™ Fa. ACDSee, Miami, USA
¾ Digital Imaging System, Image Quant 5.2 Fa. Panasonic, Wiesbaden, D
¾ Microplate Manager™ PC (Version 5.2 ©1996) Fa. BIO RAD Laboratories GmbH, München, D
¾ Plastikschweißgerät Fa. Hit® Company, D
Material und Methoden - 23 - 2.1.2 Verbrauchsmaterialien
¾ Einmal-Spritzen (5,0 ml) Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D
¾ Einmal-Sterilfilter; 0,2 µm LM-fest Fa. Sartorius AG, Göttingen, D
¾ gelbe Einmal-Kanülen Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D
¾ Gewebekulturflaschen (25 cm², 75 cm², 150 cm²) Fa. Biosciences, Bedford, USA
¾ 6-, 12-, 24-, 96-Wellplatten Fa. Falcon Becton Dickinson&Company, NJ, USA
¾ Mikrotiterplatten / 96-Wellplatten Fa. Nalge Nunc International, Wiesbaden, D
¾ Falcontubes (15 ml; 50 ml) Fa. Falcon Becton Dickinson&Company, NJ, USA
¾ Eppendorfreaktionsgefäße 1,5 ml und 2,0 ml Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, D
¾ Cryoröhrchen 1,8 ml Nalgene® Cryoware™ Fa. Nalge Company, Rochester, NY, USA
¾ Micro-PCR-Tubes (0,2 ml) Fa. Biozym Scientific GmbH, Hess.Oldendorf, D
¾ Combitips plus 0,5 ml; 1,0 ml Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, D
¾ Einmal-Pipetten, steril verpackt, (1;2;5;10;25ml) Fa. Falcon Becton Dickinson&Company, NJ, USA
¾ Pipettenspitzen (1-5 ml; 100-1000 µl;10-100 µl; Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, D 50-200 µl; 2-20 µl; 0,2-10 µl; 0,1-2,5 µl)
¾ Pipettenspitzen Filter Tips 10E Fa. Greiner Bio-one GmbH, Kremsmünster, A
¾ Pasteurpipetten Fa. Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, D
¾ Nunc Tissue Culture Inserts (Porengr. 0,4 µm) Fa. NUNC™ Brand Products, Naperville, USA
¾ Titan-Kirschner-Drähte Fa. Synthes, AO/ASIF, AG Chur, CH
¾ Universalindikator (pH 0-14) Fa. Merck, Darmstadt, D
¾ Satin Plus® Einmalhandschuhe Fa. Safeskin GmbH, Neufahrn, D
¾ fusselfreies Filterpapier Kimwipes-Lite Fa. Safeskin GmbH, Neufahrn, D
¾ Klarsichtfolie
2.1.3 Chemikalien
¾ Kollagenase II Fa. Seromed Biochrom AG, Berlin, D
¾ DEPC (Diethylpyrocarbonat) Fa. Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, D
¾ Ethanol 70%; 80% und 96%-100% Fa. Merck, KgaA, Darmstadt, D
¾ Fötales Kälberserum (FBS) 50ml/500ml(S0115) Fa. Seromed Biochrom AG, Berlin, D
¾ 20%-ige (D-)Glucoselösung Fa. Merck, KgaA, Darmstadt, D
¾ DMSO (Dimethylsulfoxide) Fa. Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, D
¾ MEM-Earle Fa. Seromed Biochrom AG, Berlin, D
¾ HAM’s F12 Fa. Seromed Biochrom AG, Berlin, D
¾ DMEM (Dulbecco’s MEM) Fa. Seromed Biochrom AG, Berlin, D
¾ DULBECCO PBS w/o (Phosphat Buffered Saline) Fa. Seromed Biochrom AG, Berlin, D ohne Mg 2+, Ca 2+
¾ Penicillin- / Streptomycin-Lösung Fa. Seromed Biochrom AG, Berlin, D
Material und Methoden - 24 -
¾ ß-Glycerophosphat Fa. Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, D
¾ L-Ascorbat-2-Phosphat Fa. Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, D
¾ Trypsinlösg. 2,5% w/v, in PBS w/o (Ca2+, Mg2+-frei) Fa. Seromed Biochrom AG, Berlin, D
¾ EDTA-Lösung (0,5 M) Fa. Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, N.Y., USA
¾ Trypanblaulösung T6146 Fa. Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, D
¾ isotone Natrium-Chloridlösung 0,9% Fa. Merck, KgaA, Darmstadt, D
¾ Methanol Fa. Merck, KgaA, Darmstadt, D
¾ 3% Silbernitrat Fa. Merck, KgaA, Darmstadt, D
¾ 5% Natriumthiosulfat Fa. Merck, KgaA, Darmstadt, D
¾ Pikro-Fuchsin 2E 050 Fa. Chroma®Waldeck GmbH&CoKG, Münster, D
¾ 0,9 g Trizma Base Fa. Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, D
¾ 6,6 g Trizma Hydrochlorid Fa. Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, D
¾ NaOH Fa. Merck, KgaA, Darmstadt, D
¾ HCl Fa. Merck, KgaA, Darmstadt, D
¾ 25 ml 0,1 M Acetat-Puffer (pH 9,4) Fa. Dr.K.Hollborn&Söhne, Leipzig, D
¾ 25 mg Echtblausalz Fa. Chroma®Waldeck GmbH&CoKG, Münster, D
¾ 12,5 mg Naphtol-AS-MX-Phosphat Fa. Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, D
¾ ß-Mercaptoethanol Fa. Merck KgaA, Darmstadt, D
¾ Albumin-Standard (BSA 2,0 mg/ml) Fa. Pierce; Perbio Sience GmbH, Bonn, D
¾ RLT-Puffer für den RNeasy Mini Kit Fa. Qiagen, Hilden, D
¾ Poly (D,L-Laktid) Fa. Boehringer IngelheimPharmaGmbH&CoKG,D
¾ rekombinantes-humanes BMP-2 Fa. Osteogenetics GmbH, Würzburg, D
2.1.4 Kits und Mikroarray-Reagenzien
¾ RNeasy Mini Kit (Cat. No. 74104) Fa. Qiagen, Hilden, D
¾ GEArrayTM Q Series KIT for non-radioactive Fa. SuperArray Bioscience Corp., Frederick, USA (chemiluminescent) Detection,
Human Osteogenesis Gene Array
¾ Desoxyribonuclease I (DNase I), Ampl. Grade Fa. Life Technologies, Grand Island, N.Y., USA
¾ MMLV (Reverse Transcriptase) (200 U/ml) Fa. Promega GmbH, Mannheim, D
¾ RNase Inhibitor (40 U/ml) Cat.No.N2511 Fa. Promega GmbH, Mannheim, D
¾ DTT (1 M) (Dithiothreitol) Fa. Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, D
¾ dNTP Mix (5 mM dATP, 5 mM dGTP, Fa. Promega GmbH, Mannheim, D 5 mM dCTP, 500 µM dTTP)
¾ Sheared salmon sperm DNA Fa. Life Technologies, Grand Island, N.Y., USA
¾ Non-radioactive Biotin-16-dUTP (1 mM) Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, D
Material und Methoden - 25 - 2.1.5 Lösungen, Medien, Puffer
Primärosteoblastenmedium:
Zu MEM-Earl und HAM’s F12 (1:1) wurden 10%-iges hitzeinaktiviertes FBS (Fötales Bovines Serum), ß-Glycerophosphat (0,05 mM) und L-Ascorbat-2-Phosphat (0,05 mM) beigemengt. Zusätzlich wurden Antibiotika Penicillin / Streptomycin (100 U/ml und 10.000 E / 10.000 µg/nl) in einer 1:100 Verdünnung zugegeben.
RNAse freies Wasser:
Zur Herstellung von RNase-freiem Wasser inkubierten Aqua Dest mit 0,1% DEPC (Diethylpyrocarbonat) über Nacht bei Raumtemperatur. Danach musste der Ansatz 3x autoklaviert werden, um Spuren von DEPC zu zersetzen.
Puffer-BN für Mikroarray:
Der Puffer-BN wurde für den RT-Cocktail (Mikroarray) aus 50 µl 10X RT-Puffer, 1 µl DTT (1M) und 50 µl dNTP-Mix hergestellt. Die Lagerung erfolgte bei –20°C. Im GEArrayTM Q Series KIT for non-radioactive (chemiluminescent) Detection von Fa. SuperArray Bioscience Corp. (Frederick, USA) war der 10X RT-Puffer inbegriffen. Für den dNTP-Mix wurden in 84,5 µl deionisiertem Wasser jeweils 5 µl dATP (100 mM), dCTP (100 mM), dGTP (100 mM) und 0,5 µl dTTP (100 mM) gegeben. DTT (Dithiothreitol) ist ein Reagenzium, welches Disulfidbindungen von Enzymen und anderen Proteinen reduziert und Monothiole in ihrem reduzierten Zustand erhält.
TRIZ-Puffer
In 1 l DEPC-Wasser wurden 8,78 g NaCl, 0,9 g Trizma Base und 6,6 g Trizma Hydrochlorid gegeben. Ein pH-Wert von 9,4 bzw. von 7,4 wurde mit NaOH bzw. HCl eingestellt.
20X SSC-Lösung:
175,3 g NaCl und 88,2 g Na3Citrat·2H2O wurden in 900 ml destH2O gelöst. Mit HCl (1M) wurde ein pH von 7,0 eingestellt und mit destilliertem H2O auf 1000 ml aufgefüllt.
20% SDS-Lösung:
200 g SDS wurde mit H2O auf 1000 ml aufgefüllt. Um das SDS zu lösen, wurde es auf 65°C erhitzt.
Waschlösung I und II für Mikroarray:
Für 10 ml Waschlösung I wurden 1 ml SSC und 0,5 ml SDS in 8,5 ml deionisiertes Wasser gegeben.
Für 10 ml Waschlösung II wurden 0,05 ml SSC und 0,25 ml SDS in 9,7 ml deionisiertes Wasser gegeben.
Material und Methoden - 26 -