V. Material und Methoden
1. Material
1.1 Material für molekularbiologische Methoden
Ultra PureTM Agarose Invitrogen (Karlsruhe)
1 kB DNA Leiter Invitrogen (Karlsruhe)
OneTaq®QuickLoad® 2xMM w/Std Buffer NEB (Ipswich, USA)
pENTR Directional TOPO® Cloning Kits Invitrogen (Karlsruhe)
In Fusion HD® Cloning Kit Takara Bio (CA, USA)
Gateway® LR Clonase Enzym Mix Invitrogen (Karlsruhe)
FastDigest Restriktionsendonukleasen Invitrogen (Karlsruhe)
Fast Digest Buffer 10x green Invitrogen (Karlsruhe)
BSA 10x Invitrogen (Karlsruhe)
Proteinase K Invitrogen (Karlsruhe)
QuikChange II Site Directed Mutagenesis Kit Agilent (Santa Clara, CA)
PfuUltraTM HF DNA Polymerase Stratagene (Heidelberg)
10x PfuUltraTM HF DNA Polymerase Buffer Agilent (Santa Clara, CA)
Taq Poymerase PeqLab (Darmstadt)
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen (Hilden)
JETQUICK PCR Product Purification Spin Kit Genomed (Löhne)
PAXgene® Blood RNA Kit 50, v2 PreAnalytiX
SuperScript IV Reverse Transkriptase Systems Invitrogen (Karlsruhe)
Ampicillin Sigma (Taufkirchen)
Kanamycinsulfat Fluka (Steinheim)
Midori Green Advanced DNA Stain NIPPON Gen. EU (Düren)
Orange-G Sigma (Taufkirchen)
Select Agar Gibco
Exonuklease I GE Healthcare (Chicago)
FastAPTMThermosensitive Alkaline Phosphatase Invitrogen (Karlsruhe) ABI BigDye Terminator Sequencing Kit v.1.1 Invitrogen (Karlsruhe)
dNTPs Invitrogen (Karlsruhe)
Hi-DiTM Formamid Invitrogen (Karlsruhe)
DNA-Isolierungs Kit aus Blut Quiagen (Hilden)
TruSightTM Rapid Capture Kit Illumina, (San Diego, CA)
MiSeq Reagent Kit v.2 Illumina, (San Diego, CA)
SureSelectXT Human All Exon V6 Agilent (Santa Clara, CA)
Nextera Exome Enrichment Kit Illumina, (San Diego, CA)
SureSElectXT Automated target Enrichment Agilent (Santa Clara, CA)
MLPA Kit P065, P066, P148, P155 MRC Holland 188
36
1.2 Material für proteinbiochemische Arbeitstechniken Protease-Inhibitoren und Detergentien:
Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tabletten Roche (Mannheim)
Complete Mini PhosSTOP Tabletten Roche (Mannheim)
Nonident P40 / Igepal ICN (Eschwege)
Polyoxyethylensorbitan Monolaurat (Tween 20) Sigma (Taufkirchen)
Triton X-100 Sigma (Taufkirchen)
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) / Western-Blotting
Natrium-Dodecylsulfat (SDS) Sigma (Taufkirchen)
Acrylamid/Bisacrylamid (AA/BAA, 30%/0,8%) Biorad (München) N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma (Taufkirchen)
Ammoniumpersulfat (APS) Sigma (München)
Dithiothreitol (DTT), 1M Invitrogen (Karlsruhe)
PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder Invitrogen (Karlsruhe) Precision Plus ProteinTM Unstained Standard Biorad (München)
PVDF Western Blotting Membran Roche (Mannheim)
Magermilchpulver für Western-Blotting Karl Roth (Karlsruhe)
Bromphenolblau Sigma (Taufkirchen)
Whatman-3MM-Chromatographie-Papier Whatman (Kent, England)
Mini-PROTEAN® TGX Stain-FreeTM Gels Biorad (München)
Trans-Blot® TurboTM Midi-Size Transfer Stacks Biorad (München) Trans-Blot® TurboTM Midi-Size LF PVDF Membrane Biorad (München)
Trans-Blot® TurboTM 5x Transfer Buffer Biorad (München)
Detektion der Antikörper-Reaktion beim Immunnnachweis:
ECLTM Western Blotting Detection Reagenzien Amersham Biosci. (Freiburg)
Hyperfilm ECL Röntgenfilme Amersham Biosci. (Freiburg)
Präzipitationen und Cleavage Experimente:
GFP-Trap® Beads ChromoTek (Planegg)
Anti-HA Magnetic Beads Invitrogen (Karlsruhe)
PamGene® Technologie
Rekombinantes CDKL1 Protein SignalChem
Rekombinantes CDKL5 Protein SignalChem
1.3 Materialien für zellbiologische Methoden Zellkultur:
Dulbecco’s modifiziertes Eagle Medium (DMEM) Gibco (Karlsruhe)
Fötales Rinderserum (FBS) Sigma (Taufkirchen)
10.000 U/mL Penicillin & 10.000 µg/mLStreptomycin Invitrogen (Karlsruhe)
TrypLETM Express Gibco (Karlsruhe)
Hygromycin B Invitrogen (Karlsruhe)
Thymidin Sigma (Taufkirchen)
37 Transfektion:
TurboFect Transfection Reagent Invitrogen (Karlsruhe)
Neon® Transfection System Invitrogen (Karlsruhe)
Immunfluoreszenzfärbungen:
Ziegen-Serum Sigma (Taufkirchen)
Paraformaldehyd Sigma (Taufkirchen)
Albumin aus Rinderserum Sigma (Taufkirchen)
AccuCheck Counting Beads Invitrogen (Karlsruhe)
ADP-GloTM Kinase Assay Promega (Mannheim)
1.4 Sonstige Chemikalien
Ethylendinitrilotetraessigsäure, Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA) Merck (Darmstadt)
TRIZMA® BASE 189 Sigma (Taufkirchen)
Glycin Carl Roth (Karlsruhe)
Hefeextrakt Invitrogen (Karlsruhe)
Bacto Tryptone BD Pharmingen (Heidelberg)
Natriumchlorid (NaCl) Baker (Deventer, NL)
Calciumchlorid (CaCl2) Merck (Darmstadt)
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck (Darmstadt)
di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) Merck (Darmstadt)
Magnesiumchlorid (MgCl2) Sigma (Taufkirchen)
Magnesiumsulfat (MgSO4) Sigma (Taufkirchen)
Ethanol (CH3CH2OH) Merck (Darmstadt)
Methanol (CH3OH) Merck (Darmstadt)
Isopropanol (C4H10) Merck (Darmstadt)
Salzsäure (HCl) Merck (Darmstadt)
Kaliumchlorid (KCl) Sigma (Taufkirchen)
Kaliumhydroxid (KOH) Sigma (Taufkirchen)
Natriumhydroxid (NaOH) Sigma (Taufkirchen)
Dimethyl Sulphoxide (DMSO) Hybri-Max® Sigma (Taufkirchen)
Manganchlorid (MnCl2) Sigma (Taufkirchen)
Robidiumchlorid (RbCl) Sigma (Taufkirchen)
Glucose Sigma (Taufkirchen)
Kaliumacetat (KAc) Carl Roth (Karlsruhe)
Eisessig Schuchart (Hohenbrunn)
Glycerin Carl Roth (Karlsruhe)
Phosphorsäure (H3PO4) Merck (Darmstadt)
Formaldehyd-Lösung Sigma (Taufkirchen)
38 1.5 Bakterienstämme und Zelllinien
Name Genotyp bzw. Eigenschaften Herkunft
Bakterienstämme
DH10B F– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK λ–
rpsL(StrR) nupG
Invitrogen (Karlsruhe) BL21 F– ompT hsdSB (rB–, mB–) gal dcm (DE3) Invitrogen
(Karlsruhe) TOP10 F– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74
recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK λ– rpsL(StrR) endA1 nupG
Invitrogen (Karlsruhe) StellarTM F–, endA1, supE44, thi-1, recA1, relA1, gyrA96, phoA,
Φ80d lacZΔ M15, Δ (lacZYA -argF) U169, Δ (mrr -hsdRMS -mcrBC), ΔmcrA, λ–
Takara Bio Inc.
(CA, USA)
Zelllinien
HEK293T Humane embryonale Zellen aus der Niere, adhärent, epitheliale Morphologie, Derivat der HEK293 Zelllinie, SV40 T-Antigen
ATCC
(Manassas, USA) HeLa Humane adulte Zervix-Zellen, adhärent, epitheliale
Morphologie
ATCC
(Manassas, USA)
1.6 Plasmide
1.6.1 Ausgangsvektoren für Klonierungen
Name Eigenschaften Herkunft Referenz
Expression in Eukaryoten
pMT2sm-HA Ampr,
HA-Epitop
Reza M. Ahmadian (Dortmund)
Kaufman et al., 1987
pEGFP-C1 Kmr,
EGFP-Epitop
Takara Bio Inc.
(Mountain View, CA)
pEGFP-TEV Kmr,
EGFP-Epitop, TEV-Epitope
dieser Arbeit
pIREShyg3 Ampr, HygBr
Internal ribosome entry site (IRES) aus ECMV
Clontech Laboratories Inc., Takara Bio Inc.
(Mountain View, CA) pCMV5B-HA-SMAD2 Ampr,
HA-Epitope
Jeff Wrana (Toronto, Kanada);
Kommerziell erworben bei Addgene
Eppert et al., 1996
39
Name Eigenschaften Herkunft Referenz
Expression in Eukaryoten
pCMV5B-FLAG-SMAD3
Ampr,
FLAG-Epitope
Jeff Wrana (Toronto, Kanada);
Kommerziell erworben bei Addgene
Labbe et al., 1998
pCS2+ Ampr,
SP6 Promotor (in vitro RNA-Synthese)
Melanie Philipp (Ulm)
GatewayTM - Vektoren
pENTRTM/D-TOPO® Kmr, ccdB Invitrogen (Karlsruhe)
pFLAG-CMV4-DESTTM
Ampr,
FLAG-Epitope
Georg Rosenberger (Hamburg)
pMT2sm-HA-DESTTM Ampr, HA-Epitope
Georg Rosenberger (Hamburg)
pCR4-TOPO®-CDKL1 Kommerziell erworben bei
Addgene
1.6.2 Hergestellte Konstrukte
Konstrukte für die eukaryotische Expression
Konstrukt Oligonukleotide Template Methodik
pMT2sm-HA-CDKL1
CDKL1-pMT2sm-HA-SalI-F CDKL1-pMT2sm-HA-SalI-R
pCR4-TOPO® -CDKL1
In-Fusion®
pEGFP-C1-CDKL1
InFu_CDKL1_pEGFP-C1_BglII_F InFu_CDKL1_pEGFP-C1_SalI_R
pMT2sm-HA-CDKL1 In-Fusion® pEGFP-TEV TEV_For
TEV_Rev
QC_pEGFP-TEV-C1-GATC_For QC_pEGFP-TEV-C1-GATC_Rev
pEGFP-C1 In-Fusion®, Quik Change
pEGFP-TEV-C1-CDKL1
InFu_CDKL1_pEGFP-TEV_BglII_F
InFu_CDKL1_pEGFP-C1_SalI_R
pEGFP-C1-CDKL1 In-Fusion®
pIREShyg3-HA-CDKL1
NheI-HA-For
CDKL1-EcoRV-Rev
pMT2sm-HA-CDKL1 Rekombination (Endonukleasen)
Konstrukte für die Expression in Zebrabärblingen
Konstrukt Oligonukleotide Template Methodik
pCS2+ EcoRI-HA-For
CDKL1-XhoI-Rev
pMT2sm-HA-CDKL1 Restriktion &
Ligation
40
Im Rahmen der Vorarbeiten zu dieser Arbeit mittels Gateway®-Technologie hergestellte Konstrukte für die eukaryotische Expression
Konstrukt Oligonukleotide Template Methodik
Eingangs- Konstrukt
pENTRTM /D- TOPO®-SMAD2
SMAD2-pEDT-F2 SMAD2-pEDT-R
pCMV5B-HA-SMAD2
Topoisomerase Reaktion pENTRTM
/D- TOPO®-SMAD3
SMAD3-pEDT-F SMAD3-pEDT-R
pCMV5B-FLAG-SMAD3
Topoisomerase Reaktion
Zielkonstrukte
pFLAG-CM4-DESTTM -SMAD2
Rekombination aus pENTRTM /D-TOPO®-SMAD2
pFLAG-CM4-DESTTM -SMAD3
Rekombination aus pENTRTM /D-TOPO®-SMAD3
pMT2sm-HA-DESTTM -SMAD2
Rekombination aus pENTRTM /D-TOPO®-SMAD2
pMT2sm-HA-DESTTM -SMAD3
Rekombination aus pENTRTM /D-TOPO®-SMAD3
1.7 Oligonukleotide
1.7.1 Oligonukleotide für Klonierungen
Oligonukleotidname Oligonukleotidsequenz
CDKL1-pMT2sm-HA-SalI-F 5’–CAGATTACGCGTCGACTATGATGGAGAAGTATGAAAAAATTGG–3‘
CDKL1-pMT2sm-HA-SalI-R 5’–GGCCGCCCGGGTCGATTAAATGTTTGGAAAACGGTAGTTAAG–3‘
InFu_CDKL1_pEGFP-C1_BglII_F 5‘–GTCCGGACTCAGATCTATGGAGAAGTATGAAAAAATTGGGA–3‘
InFu_CDKL1_pEGFP-C1_SalI_R 5’–CCGCGGTACCGTCGACTTAAATGTTTGGAAAACGGTAGTT–3‘
TEV_For 5‘–CCGGGAGCTCCGAGAACCTGTATTTCCAGGGTAGCTCCTCCGGA–3‘
TEV_Rev 5‘–GATCTTCCGGAGGAGCTACCCTGGAAATACAGGTTCTCGGAGCTC–3‘
QC_pEGFP-TEV-C1_GATC-For 5’–CTCCTCCGGAAGATCTCGAGCTCAAGCTTC–3‘
QC_pEGFP-TEV-C1_GATC-Rev 5’–GAAGCTTGAGCTCGAGATCTTCCGGAGGAG–3‘
InFu_CDKL1_pEGFP-TEV_BglII_F 5‘–CTCCTCCGGAAGATCTATGATGGAGAAGTATGAAAAAATTG–3‘
NheI-HA-For 5‘–GCTAGCATGGCTTACCCATACGATGTT–3‘
CDKL1-EcoRV-Rev 5‘–GATATCTTAAATGTTTGGAAAACGGTAGTTAAGTTTC–3‘
EcoRI-HA-For 5‘–CCGGAATTCATGGCTTACCCATACGATGTT–3’
CDKL1-XhoI-Rev 5’–CTCGAGTTAAATGTTTGGAAAACGGTAGTTAAGTTTC–3’
SMAD2-pEDT-F2 5‘–CACCATGTCGTCCATCTTGCCATTCACGCCGCCAG–3‘
SMAD2-pEDT-R 5‘–TTATGACATGCTTGAGCAACGCACTGAAGG–3‘
SMAD3-pEDT-F 5’–CACCATGTCGTCCATCCTGCCTTTCACTCCC–3‘
SMAD3-pEDT-R 5‘–CTAAGACACACTGGAACAGCGGATGCTTGG–3‘
41
cDNA-T7 5’–TAATACGACTCACTATAGGG–3’
T7-Klone-M13R 5’–CAGGAAACAGCTATGACC–3’
1.7.2 Oligonukleotide für QuikChange® II Site Directed Mutagenesis Oligonukleotidname Oligonukleotidsequenz
CDKL1_T430C_C144R_F 5’–AACATTCCGTGATTAAGCTTCGTGACTTTGGATTTGCTCG–3’
CDKL1_T430C_C144R_R 5’–CGAGCAAATCCAAAGTCACGAAGCTTAATCACGGAATGTT–3’
CDKL1_C620T_S207L_F 5’–CCTCTGTGGCCAGGAAAATTGGAGTGGATCAGC–3’
CDKL1_C620T_S207L_R 5’–GCTGATCCACTCCAATTTTCCTGGCCACAGAGG–3’
CDKL1_D208K_F 5’–GTGGCCAGGAAAAATCGAAGGTGGATCAGCTGTATC–3’
CDKL1_D208K_R 5’–GATACAGCTGATCCACCTTCGATTTTTCCTGGCCAC–3’
CDKL1_A101G_K34R_F 5’–GTCAGATTGTGGCCATCAGGAAGTTTCTGGAATCAGA–3’
CDKL1_A101G_K34R_R 5’–TCTGATTCCAGAAACTTCCTGATGGCCACAATCTGAC–3’
CDKL1_C407T_T136M_F 5’–GCTTAATCACGGAATGTTTCATGATGAGGATATTTTCTGGC–3’
CDKL1_C407T_T136M_R 5’–GCCAGAAAATATCCTCATCATGAAACATTCCGTGATTAAGC–3’
1.7.3 Oligonukleotide für Sequenzierungen
Oligonukleotidname Oligonukleotidsequenz
pMT2sm-HA-For 5’–GATCTGGCCATACACTTGAGTG–3’
CDKL1_cDNA_seq_1F 5’–CAAATGTAGAAACAGGGACAC –3’
CDKL1_cDNA_seq_1R 5’–GGATGCTTGAGTTGCTTGAGC–3’
CDKL1_cDNA_seq_2F 5’–GAAACATTCCGTGATTAAGC–3’
CDKL1_cDNA_seq_3F 5’–GCTCCTAAAGGGCTGTCTCC–3’
pEGFP-C1_seq_For 5’–CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG–3’
pEGFP-C1_seq_Rev 5’–CTCTACAAATGTGGTATGGCTG–3’
pIREShyg3_seq_1F 5‘–GACGGATCGGGAGATCTCCCGATC–3‘
pIREShyg3_seq_1R 5‘–TTGAGAGGGAGTACTCACCCCAAC–3‘
pIREShyg3_seq_2F 5‘–CGATGTAGGAGGGCGTGGATATGT–3‘
pIREShyg3_seq_3F 5‘–GCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCG–3‘
pCS2+_seq_For 5‘–CGCCATTCTGCCTGGGGACGTCGG–3‘
pCS2+_seq_Rev 5‘–GTTCCCTAAACGAGCATTGCTTAT–3‘
SMAD2_cDNA_seq_1F 5‘–TGTTACCATACCAAGCACTTGC–3‘
SMAD2_cDNA_seq_1R 5‘–GAGACGACCATCAAGAGACC–3‘
SMAD2_cDNA_seq_2F 5‘–CCAGAAAACACTAACTTCCCAG–3‘
SMAD2_cDNA_seq_3F 5‘–GCTTATACTACATAGGTGGGGA–3’
SMAD3_cDNA_seq_1F 5‘–GCTGGAGAAGGCCATCACC–3‘
SMAD3_cDNA_seq_1R 5‘–CTACTCTCTGGTAGTGGTAG–3‘
SMAD3_cDNA_seq_2F 5‘–GGCTACCTGAGTGAAGATGG–3‘
SMAD3_cDNA_seq_3F 5‘–CAGAGTGCCTCAGTGACAGC–3‘
42 1.8 Antikörper
(WB, Western Blot; ICH, Immunhistochemie)
Antikörper Antigen Spezies Eingesetzte
Verdünnung
Hersteller
Primärantikörper
Anti-EGFP EGFP Maus WB 1:5000 Sigma
Anti-CDKL1 (polyklonal)
Humanes CDKL1, C-Terminus
(Aminosäuren 285-316)
Kaninchen WB 1:1000 IHC 1:50
Invitrogen
Anti-CDK2 (E304) Humanes CDK2, C-Terminus
Kaninchen WB 1:1000 Abcam Anti-p21 Waf1/Cip1
(12D1)
Humanes p21, C-Terminus
Kaninchen WB 1:1000 Cell Signaling Anti-Calponin1 Humanes Calponin 1,
(Aminosäuren 2-297)
Maus IHC 1:200 R&D Systems Anti-Actin Smooth
Muscle (1A4 (asm-1))
α-smooth muscle Aktin, 10 Aminosäuren des N-Terminus
Maus IHC 1:400 Invitrogen
Anti-CD34 (ICO115)
Blasten (Vorläufer-zellen weißer Blut-körperchen) von CML Patienten
Maus IHC 1:100 Santa Cruz Biotech., Inc.
Anti-STRO1 Humane CD34+ Zellen des Knochenmarks
Maus IHC 1:50 Invitrogen
Antikörper Antigen Konjugat Spezies Eingesetzte Verdünnung
Hersteller
Sekundärantikörper
Anti-HA-HRP, High Affinity (3F10)
Humanes Hämagglutinin
HRP Ratte WB 1:10.000 Roche (Mannheim) Anti-mouse IgG
F(ab’)2-HRP
IgG F(ab’)2 aus Schaf
HRP Schaf WB 1:10.000 Amersham Anti-rabbit IgG-HRP IgG
aus Kaninchen
HRP Maus WB 1:10.000 Dianova Anti-rabbit
IgG-DyLight800
IgG
aus Kaninchen
DyLight 800
Schaf WB 1:10.000 BioRad
43