3 Materialien und Methoden
3.2 Methoden
3.2.2 Molekulargenetische Methoden
3.2.2.1 Polymerase Kettenreaktion
Im Falle der selektiven CYP11B1-Primer lag die Selektivität in der Nutzung einer 4 bp gro
Da eine größere Anzahl Kandidatengene in die Entwicklung der Feinkartierung im auf BTA14 aufgenommen wurden und entsprechend zahlreiche PC
ll etabliert. Mit Primern, die optimaler Weise eine Schmelztemperatur (T
notwendig erscheinenden Art und Weise abgeändert. Die am
ßen “Deletionslücke” der DNA Sequenz. Aus diesem Grunde musste die DNA-Sequenz an dieser Stelle unverändert als PCR-Primer übernommen werden.
3.2.2 Molekulargenetische Methoden
Das Austesten der optimalen Annealingtemperatur erfolgte mit einem Temperaturgradienten-Cycler (BIORAD) in einem Variationsbereich von 8 Temperatur-sprüngen. Dabei wurde immer darauf geachtet, dass die Gradientenabstufung in ganzen Gradschritten erfolgte. Obwohl Annealingtemperaturen in der Regel 2-5°C unter
ittlere Annealingtemperatur im ehrzahl der nach erfolgtem Essay selektionierten An
Primerschmelztemperaturen liegen, wurde 60°C als m Testgradienten angenommen. Die M
nealingtemperaturen im PCR-System betrug ebenfalls 60°C.
PCR-Additive: DMSO TWEEN20 TRITON X-100
Abbildung 3.4: Drei identische PCR-Ansätze mit unterschiedlichen Enhancer-Substanzen im Temperaturgradienten von 63°C (links) bis 56°C (rechts), getrennt durch DNA
Größenmarker. PCR-Additive sind DMSO (links), Tween20 (Mitte) und Triton X-100 (rechts).
3.2.2.1.2 PCR-Optimierung
Um die Produktausbeute, Produktspezifität und Produktkonsistenz pro PCR-Reaktion zu optimieren, werden neben der Möglichkeit die PCR-Substanzen mengenmäßig zu variieren auch unterschiedliche Substanzen als Additive genutzt. Im Rahmen dieser Arbeit kamen DiMethylSulfOxid (DMSO), Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat (Tween20) und Alkylphenyl-polyethylenglykol (Tritin X-100) zur Anwendung (Abb. 3.4). DMSO unterstützt den PCR Vorgang durch Destabilisierung des Inter- und
Templates in PCR Reaktionen eingesetzt. Aus den gleichen Gründen k a Terminator
equen ktion n zum Einsatz. een20 wird pharmazeutisch als Emulsions- oder ispers z g nd k runreinigun emplate neutralisieren (Innis et l. 1999). Triton -100 ist a icht io und
eschrie a n in der PCR n die Pro erhöhen (Innis et al. 1999).
Reannealings der DNA und wird gezielt bei GC reichen
ommt es uch bei Dye
S zierrea e Tw
D ionsagen enutzt u ann Ve gen im T
a X ls ein n nisches oberflächenaktives Mittel
b ben und k n -Reaktio duktmenge
Tabelle 3.3: Cycler-Temperaturgradienten-Protokoll zum Etablieren der PCR-Systeme
Schritt Temperatur Zeit Zyklen
1 94°C 3′
2 94°C 30″
3 57°C-64°C 30″ x 30
4 72°C 30″-45″
5 72°C 10′
6 4°C ∝
3.2.2.1.3 PCR-Variationen
Da Nested-PCR (Newton & Graham 1994) durch die Verwendung von PCR-Produkt als Template in einer neuen PCR-Reaktion eine außerordentlich empfindliche Methode darstellt wächst die Anfälligkeit für Verunreinigungen und Nebenprodukte. Sie wurde nur
der bei uch bei
ohl temperaturen, generell in hohen Temperaturabschnitten, wesentlich weniger
ezifischer als in niedrigeren Temperaturbereichen. Auf diese W
initiale Denaturierung bei 95°C für 15 min zur Aktivierung der Polymerase gleichzeitig zum Denaturieren der als Template verwendeten Zellen einer gepickten Kolonie zu nutzen.
Bei einer Verwendung von gewöhnlicher Taq-Polymerase wurden die gepickten Zellen vorher denaturiert, indem sie in 60 µL Tris-Puffer (10 mM, pH 8) suspendiert und bei 99°C selten, hauptsächlich bei unerklärlich schwacher Amplifikation o
Templateknappheit eingesetzt.
Touch-down-PCR (Don et al. 1991) erbrachte spezifische Produkte und wurde a Amplifikationen mit Selektivprimern für das CYP11B1-Gen eingesetzt. Obw Annealing
effizient sind, sind sie aber sp
eise werden in den ersten Zyklen hochspezifische Moleküle vervielfältigt, die anschließend für die exponentielle Amplifikation als Template zur Verfügung stehen. Da intra- und intermolekulare Vorgänge, die durch Temperaturerhöhung erzeugt werden jedoch nicht direkt kontrollierbar sind, wurde an Stelle einer konstant erhöhten Temperatur ein abnehmender Temperaturgradient genutzt. Primersysteme die bei einer bestimmten Annealing Temperatur etabliert waren, wurden mit einem Vorlauf von 10°C Temperaturerhöhung gestartet, welcher in jedem folgenden Zyklus 1°C abnahm und nach den ersten 10 Zyklen die ausgetestete Annealingtemperatur erreichte. Dem schlossen sich weitere 30 Zyklen mit konstanter Annealingtemperatur an.
Kolonie-PCR (Hofmann & Brian 1991) stellt eine schnelle und erste Überprüfungs-möglichkeit sowie Erfolgskontrolle beim Klonieren und nach BAC-Screening dar.
Kolonie-PCR wurde mit Hotstar Taq-Polymerase durchgeführt, um die hierbei notwendige
für 1 min inkubierten. E.coli Zellen wurden entweder mit einer sterilen Pipette von einer garplatte mit Selektionsme t oder wurden dem Anzuchtmedium entnommen.
a Vektor-Primer das gesamte Klonierungsprodukt flankieren, das durch seine Größe die apazität der Taq olimerase in einer PCR-Reaktion jedoch überfordern könnte, wurden e nicht zur Kolonie-PCR eingestzt. Die genutzten PCR-rimern lieferten r spezifischere Ergebnisse.
Long-range-PCR (Barnes et al. ) kann einer Mischung a s Taq-Polymerase ostabilen DNA-Polymerase mit Proofreading-Aktivität normale
ard-PCR weit übertreffen. Im Rahmen der vorliegenden Ar
mehrmaliges vorsichtiges Durchziehen des Pipettenhubs wu
A dium gepick
D
K -P
si zum BAC-Bank- Screening
P hie
1994 mit u
und einer therm
Größenlimitierung von Stand
beit wurden anstelle kommerzieller Kits, mit vorhandenen PCR-Substanzen eigene Protokolle entwickelt, die in 2 separaten Volumina (Lösung I, Lösung II, siehe Tabelle 3.4) vorgemischt wurden. Nach einer initialen Denaturierung von 96°C für 15 min. von 'Lösung I' wurden die Reaktionsgefäße, im Cycler verbleibend, nochmals geöffnet und 'Lösung II' zugegeben. Durch
rden die Lösungen gemischt und anschließend die Reaktionsgefäße wieder verschlossen. Dazu war ein Wartezyklus von 68°C für 2 min. im Temperatur-Programm des Cyclers vorgesehen. Tabelle 3.4 zeigt ein derartiges Long-range PCR-Protokoll aus einem in zwei Teile getrennten 50 µL Ansatz, mit dem dazugehörigen Cycler-Temperatur-Protokoll in Tabelle 3.5 in Form einer Touch-down-PCR.
Tabelle 3.4: Long-range PCR-Protokoll aus einem in zwei Teile getrennten 50 µL Ansatz.
Lösung I
Konzentration Stock
Volumen Reaktion
Konzentration Gesamtreaktion
H2O -- -- 1,25 µL -- --
DMSO 100 % 0,75 µL 1,5 %
Glycerol 50 % 8,00 µL 8,0 %
dNTP 2,0 mM 7,50 µL 0,3 mM
Primer 1 10 pM 5,00 µL 1,0 pM
Primer 2 10 pM 5,00 µL 1,0 pM
DNA 50 ng/µL 2,50 µL
gesamt 30,00 µL
125 ng Lösung
II
Konzentration Stock
Volumen Reaktion
Konzentration Gesamtreaktion
H2O -- -- 13,75 µL -- --
Puffer mit 15 mM MgCl2 10 x 5,00 µL 1 x
MgCl2 25 mM --- µL 1,5 mM
Taq 5 U/µL 1,00 µL 2 U
PWO 1 U/µL 0,25 µL 0,1 U
gesamt 20,00 µL
Tabelle 3.5: Cycler-Temperatur-Protokoll zur Long-range-PCR
Schritt Temperatur Zeit Zyklen
1 96°C 15′ x 1
2 68°C 2′ x 1 (Wartezyklus)
3 92°C 10″
4 62-50°C 30″ x 30
5 68°C 7′
6 68°C 30′ x 1
7 4°C ∝
3.2.2.1.4 Aufreinigen der PCR Produkte
PCR-Produkte wurden vor einer weiteren Verarbeitung zum Sequenzieren, zur Entfernung überschüssiger Primer, restlicher Puffer-Salze und nicht eingebauter dNTP über QIAquick Säulen, Wizard® SV Gel und PCR Clean-Up System Säulen oder über MontageTM PCR Centrifugal Filter Devices ach Protokollen der Hersteller aufgereinigt.
Zur Konzentrationsbestimmung und als Kontrolle des Vorkommens von Nebenprodukten wurden PCR-Produkte bereits bei Etablierung aber in der Regel erneut vor der Sequenzierung auf einem Agarosegel überprüft.