3.2.1 CAM-Assay auf Gallus gallus domesticus und Coturnix coturnix japonica
Die CNS-1-rMCP-1-Gliomzellen wurden auf der CAM in 35 Eiern und die CNS-1-pcDNA-Kontrollzellen in 37 Eiern appliziert. Davon erfolgte bei beiden Tumorzelllinien für zwei Eier kein Wachstum von Tumoren, da die Embryonen abstarben. Bei den Kontrolltumoren zeigten 2 weitere kein Tumorwachstum. Also gab es kein erfolgreiches Wachstum bei 10,8% der Kontrolltumoren und 5,7% der MCP-1-Tumoren. Sonst kam es zum Anwachsen der Tumorzellen auf der CAM und es bildeten sich solide Tumorknoten oder größere Tumorkegel. In den Makrophotos von typischen Tumoren wurde schon bei subjektivem Vergleich ein stärkeres Wachstum der rMCP-1-transfizierten Tumoren (Abb. 11 D-F) im Gegensatz zu den Kontrolltumoren (Abb. 11 A-C) deutlich. Die Kontrolltumoren zeigten nur eine geringe Tendenz zur Bildung solider Tumoren. Sie bildeten kleine weißliche Flecken oder mäßig große Knoten aus. Das heißt, die in vitro schneller wachsenden Zellen, bildeten in vivo die kleineren Tumoren.
Abb. 11: CNS-1-Gliome auf der CAM von Gallus gallus domesticus an Tag 13 (mit Glutaraldehyd fixiert), Vergrößerung 0,8 x, Balken = 5mm; A, B und C) CNS-1-pcDNA-Kontrolltumoren; D, E und F) CNS-1-rMCP-1-transfizierte Gliome; Pfeile = Einblutungen; Beachte das deutlich stärkere Wachstum der rMCP-1-Gliome.
Weiterhin beobachtete ich eine Beeinflussung der CAM-Gefäße durch die Tumoren. Die Gefäße wuchsen in beiden Präparaten stark auf den Tumor zu, dies wurde entweder durch Trägereffekte der Thermanox-Trägerscheibe oder den Tumor selbst verursacht. So sind bei beiden Tumorzelllinien die Gefäße der CAM um den Tumor stark ausgeprägt (Abb. 11 A-F).
Jedoch erschienen die großen kegelförmigen MCP-1-produzierenden Tumoren (Abb. 11 D-F
& Abb. 12) innerhalb des Tumors wesentlich besser vaskularisiert (Abb. 12). Die Gliome waren z.T. blutig oder besaßen mäßig differenzierte Gefäßbäume mit kleineren und größeren Gefäßen, wobei die großen Gefäße bei Beobachtung am lebenden Präparat als Venen
identifiziert werden konnten. Ich habe morphologisch gleichartige Resultate bei Versuchen mit Wachteln beobachtet.
Abb. 12: CNS-1-rMCP-1-Tumor auf CAM von Gallus gallus domesticus an Tag 13 (mit Glutaraldehyd fixiert), A) Übersicht, Balken = 5mm, B) Vergrößerung, Balken = 1mm; Beachte das Gefäßsystem im Tumor bestehend aus Kapillaren und Venolen.
3.2.2 Bestimmung des Tumorvolumens
Bei der Bestimmung des Tumorvolumens habe ich 4 Kontrolltumoren mit 6 MCP-1-Tumoren verglichen. Dabei fiel auf, dass alle rMCP-1-transfizierten Tumoren zumindest ein doppelt so großes oder noch größeres Volumen als die Kontrolltumoren besaßen (Abb. 13).
Einzelne Tumorvolumina in „ l“
CNS-1 pcDNA CNS-1 rMCP-1
50 150
20 90
60 300
20 100
300 200
Bei einem Vergleich der Mittelwerte, wurde ersichtlich, dass die Tumoren mit MCP-1-Produktion ca. 5mal größer als die Kontrolltumoren gewachsen waren (Abb. 13).
Mittelwerte der Tumorvolumina p=0,031
0 50 100 150 200 250
Volumen (in µl)
CNS-1 pcDNA 37,5
CNS-1 rMCP 190
Mittelw ert
Abb. 13: Vergleich des mittleren Tumorvolumens (CNS-1 pcDNA n=4; rMCP-1 n=6) mit SEM, p = 0,031
Nach einer Analyse im Student-t-Test mit Statistica zeigte sich ebenfalls ein signifikanter p-Wert von 0,031, so dass es in vivo einen signifikanten Wachstumsvorteil der mit MCP-1 transfizierten Tumorzellen geben musste. Aufgrund der geringen Stichprobenanzahl ist dieser statistische Vergleich nicht valide. Er stimmt aber mit bereits publizierten Befunden bei Experimenten an Mäusen überein (Platten et al., 2003).
3.2.3 CAM-Assay mit humanem MCP-1
Zur Differenzierung zwischen allgemeinen Tumoreffekten und spezifischen MCP-1-vermittelten Effekten habe ich humanes MCP-1 auf die CAM 13 Tage alter Hühner- bzw. 11 Tage alter Wachtelembryonen appliziert. Am Embryonaltag 16 der Hühnerembryonen zeigten sich auf der 3 Tage behandelten CAM bei den 5 Negativkontrollen mit Aqua dest. sowohl bei normaler Hellfeldaufnahme als auch im Dunkelfeld praktisch ein normales Erscheinungsbild der CAM (Abb.14).
Abb. 14: Makroskopische Präparate der CAM mit Thermanoxscheibe als Substanzträger, aufgebracht an Tag 13 mit Aqua dest. (Negativkontrolle); Aufnahme von Präparat nach 3 Tagen mit Trägerauflage (mit Glutaraldehyd fixiert), A) Hellfeldaufnahme, B) Dunkelfeld, Balken = 2 mm; Beachte, dass keine Reaktion der CAM auf die 3 Tage aufliegende Trägerscheibe mit Aqua dest. (Negativkontrolle) stattgefunden hat.
Im Gegensatz dazu zeigten sich bei der Positivkontrolle (VEGF-A165) typische Effekte in Sinne einer deutlichen Kapillarisierung der CAM im Applikationsbereich. Die Kapillaren waren vor allem am Rand des eingetrockneten Tropfens mit VEGF-A165 stark geschlängelt und fein, Bürsten-ähnlich verzweigt (Abb. 15).
Abb. 15: Makroskopische Präparate der CAM mit Thermanoxscheibe als Substanzträger, aufgebracht an Tag 13 als Positivkontrolle mit VEGF-A165; Aufnahme des Präparates nach 3 Tagen Trägerauflage (mit Glutaraldehyd fixiert), A) Hellfeldaufnahme, B) Dunkelfeld, Balken = 2mm; Beachte die starke Kapillarisierung der CAM im Applikationsbereich von VEGF-A165 (Positivkontrolle).
Bei den mit humanem MCP-1-behandelten CAM-Präparaten kam es zu keiner Reaktion der Gefäße (Abb. 16 A, 17 A). Die Gefäße unterhalb des Trägers wirkten eher abgeblasst. Nur im Dunkelfeld konnten weißliche Eintrübungen beobachtet werden (Abb. 16 B, 17 B), die bei den Positiv- und Negativkontrollen nicht vorhanden waren (Abb. 16 B). Es könnte sich
hierbei um eine Einwanderung von Bindegewebszellen oder anderer Zellen z.B. Zellen des Vogelimmunsystems handeln.
Abb. 16: Makroskopische Präparate der CAM mit Thermanoxscheibe als Substanzträger, aufgebracht an Tag 13 mit VEGF-A (linke Scheibe) und MCP-1 (rechte Scheibe), Aufnahme nach 3 Tagen Trägerauflage (mit
Glutaraldehyd fixiert), A) Hellfeldaufnahme, B) Dunkelfeld, Balken = 5 mm; Beachte die Vaskularisierung unter VEGF-A (links im Bild, in A) und B)) und fehlende Reaktion (Hellfeld) bzw. weißliche Eintrübung (Dunkelfeld) unter MCP-1 (rechts im Bild).
Abb. 17: Makroskopische Präparate der CAM mit Thermanoxscheibe als Substanzträger aufgebracht an Tag 13 mit MCP-1; Aufnahme nach 3 Tagen Trägerauflage (mit Glutaraldehyd fixiert); Vergrößerung aus Abb.16 A) Hellfeldaufnahme, B) Dunkelfeld, Pfeil = weißliche Eintrübung, Balken = 2,5mm; Beachte in dieser Vergrößerung die Reaktionen der CAM auf MCP-1: Im Hellfeld ist keine Reaktion sichtbar, während im Dunkelfeld weißliche Eintrübungen zu sehen sind.