MACC1 interagiert mit dem Promotor des HGF-Rezeptors Met

MACC1 exprimierende Zellen zeigen eine Aktivierung des HGF/Met Signalweges und eine HGF induzierte Translokation von MACC1 in den Zellkern. Um den Mechanismus der MACC1-vermittelten HGF/Met- Signaltransduktion genauer zu analysieren, wurde mittels CAT-Reporterassays die Aktivität des Promotors der Rezeptor-Tyrosinkinase Met in parentalen SW480 Zellen und MACC1-Transfektanten verglichen.

Das verwendete, pCAT3Basic-basierte Reportersystem mit den verschiedenen Met-Promotorvarianten wurde freundlicherweise von Y. Liu zur Verfügung gestellt.¹⁴⁵ Das längste analysierte Met-Promotorkonstrukt kodierte für 2600 bp upstream des Transkriptionsstarts (2.6met-CAT). Zusätzlich wurden Deletionsvarianten des Promotors eingesetzt, um den für die MACC1-spezifische Aktivierung relevanten Sequenzbereich einschränken zu können.

Eine Übersicht über die eingesetzten Met-Promotorkonstrukte findet sich in Abbildung 3.13.

Abb. 3.13. MACC1 induziert die Met-Promotoraktivität.

ELISA in parentalen und MACC1-transfizierten Zellen. Die CAT-Expressionskonstrukte tragen definierte Fragmente des Met-Promotors.¹⁴⁵ Beide Zelllinien wurden parallel mit den gezeigten Met-Promotorvarianten transfiziert und nach 48 h die CAT-Expression im ELISA quantifiziert. Das 0.2met Promotorfragment zeigte eine stark erhöhte Aktivität in MACC1-Transfektanten, verglichen mit den parentalen SW480 Zellen. Diese Induktionsrate war stabil in allen längeren Met-Promotorkonstrukten 0.4met-CAT, 0.7met-CAT, 1.1met-CAT, 2.6met-CAT.

Nach Transfektion mit dem kürzesten Met-Promotorfragment 0.1met-CAT wurde in beiden Zelllinien eine vergleichbare Expression detektiert. Mit dem 0.2met-CAT Konstrukt transfizierte MACC1-Zellen zeigten dagegen eine 10fach erhöhte Reporterexpression im Vergleich zur parentalen Zelllinie (Abb. 3.13).

Die Transfektion der 0.4met-CAT, 0.7met-CAT, 1.1met-CAT und 2.6met-CAT-Reportergenkonstrukte in stabile MACC1-Klone führte zu ähnlich hoher Induktion der CAT-Expression.

Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass MACC1 entweder direkt oder indirekt mit dem Sequenzbereich von -223 bis -68 des 0.2met-CAT Fragments des Met-Promotors interagiert.

Um nachzuweisen, dass es sich bei der erhöhten Met-Promotoraktivität in den MACC1-Transfektanten tatsächlich um einen MACC1-spezifischen Effekt handelt, wurden die Zellen vor Transfektion mit dem 0.2met-CAT Reporterkonstrukt mit MACC1-spezifischer siRNA behandelt. Die Reduktion der MACC1 Expression mittels siRNA hat eine signifikante Reduktion der Met Promotoraktivität zur Folge (Abb. 3.14).

Abb. 3.14: Die erhöhte Met-Promotoraktivität ist MACC1-spezifisch und wird bedingt durch die MACC1-Domänenstruktur. S

W480/MACC1 Zellen wurden mit MACC1 siRNA behandelt und anschließend mit dem 0.2met-CAT Promotorkonstrukt transfiziert. MACC1 siRNA-transfizierte Zellen zeigten eine Reduktion der Reporterexpression auf etwa 35%.

Parallel wurde die CAT-Expression in 0.2met CAT transfizierten

Ergebnisse

Um die Relevanz der Domänenstruktur für die Met-Promortor-Aktivierung zu untersuchen, wurden auch die stabilen Klone der Deletionsvarianten MACC1ΔSH3, MACC1PXXP^mut und MACC1ΔSH3PXXP^mut mit dem 0.2met-CAT Konstrukt transfiziert und die Reportergen-Expression quantifiziert. In keiner der Deletionsvarianten war eine Induktion der Promotoraktivität nachweisbar. Die Deletion sowohl der SH3-Domäne als auch des PXXP-Motivs führte somit zum Funktionsverlust des Proteins.

3.5.2 MACC1 bindet an den endogenen Met-Promotor

Mit Hilfe der CAT-Reporterassays wurde gezeigt, dass die MACC1-Expression zu einer Induktion der Met-Promotoraktivität führt. Die Interaktion von MACC1 erfolgt den Daten des Reporterassays zufolge mit dem Sequenzbereich von -223 bis -68 des Met-Promotors. Um die direkte Bindung von MACC1 an dieses Fragment des endogenen Met-Promotors nachzuweisen, wurden Chromatin-Immunpräzipitations-Experimente (ChIP) durchgeführt.¹⁶⁰

Hierbei werden die an die DNA gebundenen Proteine mittels Paraformaldehyd an die DNA gekoppelt und mit Hilfe spezifischer Antikörper immunpräzipitiert. In diesem Falle wurde ein V5-spezifischer Antikörper eingesetzt. Im Anschluss wird die an das präzipitierte Protein gebundene DNA isoliert und mittels PCR die Protein-bindende Promotorsequenz amplifiziert – in dieser Analyse der betreffende Sequenzbereich des Met-Promotors von -230 bis -50 bp.

Abb. 3.15: MACC1 interagiert mit dem endogenen Met-Promotor.

Chromatin-Immunpräzipitation zum Nachweis der Bindung von MACC1 an die Met-Promotorregion -223 bis -68. Das an die DNA gebundene MACC1 wurde mittels V5-spezifischer Antikörper präzipitiert, die DNA isoliert und in einer PCR die Met-Promotorregion von -230 bis -50 amplifiziert. Als Input wurde die aus 10 % des Ausgangslysats isolierte DNA in einer Verdünnung von 1:200 eingesetzt. Zur Kontrolle der Immunpräzipitation wurde eine unspezifische Isotypenkontrolle verwendet, die PCR-Spezifität wurde mittels Met-unassoziierter, Fos-spezifischer Primer gezeigt. In SW480/MACC1-Transfektanten wurde nach IP mit V5-spezifischen Antikörpern ein Met-Promotor PCR-Produkt amplifiziert. In den Präzipitaten der parentale Linie und der drei MACC1-Domänenvarianten war die Met-Promotorsequenz dagegen nicht nachweisbar.

Die Chromatin-Immunpräzipitation wurde sowohl mit den parentalen Zellen, als auch der MACC1 Transfektante und den drei MACC1 Deletionsvarianten durchgeführt (Abb. 3.15). In den MACC1-Transfektanten konnte nach Immunpräzipitation mit V5-Antikörper der Sequenzbereich von -230 bis -50 bp des Met Promotors amplifiziert werden. Das heißt, MACC1 bindet innerhalb dieses Sequenzabschnitts an den endogenen Met-Promotor. Präzipitationen mit Kontroll IgG und PCR-Amplifikationen mit Met-unspezifischen Primern zeigten kein PCR-Signal. Die Spezifität des Nachweises ist demnach gewährleistet.

In den parentalen Zellen und den drei MACC1-Deletionsvarianten fiel die Amplifikation dagegen negativ aus. Es konnte keine Bindung von MACC1 an den Met-Promotor nachgewiesen werden. Dies korreliert mit den Ergebnissen des CAT-ELISAs. Somit konnte mit Hilfe von CAT-Reporterassays und Chromatin-Immunpräzipitation nachgewiesen werden, dass MACC1 an den Met Promotor im Bereich -223 bis -68 bindet und die Promotoraktivität erhöht.

3.6 MACC1 reguliert die Expression des HGF-Rezeptors Met in