1.1 Chemikalien und gebrauchsfertige Lösungen
0,5 M TRIS-Puffer pH 6,8 Biorad, München, D
1,5 M TRIS-Puffer pH 8,8 Biorad, München, D
100 bp DNALadder New England Biolabs, Frankfurt
aM, D
6α-Methylprednisolon Sigma Aldrich, Taufkirchen, D
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) BD Pharmingen, Heidelberg, D
Agarose Bioline, Luckenwalde, D
Ammoniumpersulfat (APS) Carl Roth, Karlsruhe, D Bovines Serumalbumin (BSA) SERVA, Heidelberg, D
Bromphenolblau Neolab, Heidelberg, D
Budesonid Sigma Aldrich, Taufkirchen, D
CellLytic Reagent M Sigma Aldrich, Taufkirchen, D
completeMini EDTAfree protease inhibitor cocktail
Roche, Mannheim, D Coomassie Brilliant Blue R250-Lösung Biorad, München, D
Cytofix/Cytoperm BD Pharmingen, Heidelberg, D
Destilliertes Wasser (A. dest) B. Braun, Melsungen, D
Dexamethason Calbiochem, Merck, Darmstadt, D
Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth, Karlsruhe, D Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4 x 2
H2O)
Merck, Darmstadt, D
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth, Karlsruhe, D
dNTP Mix, 10 mM Fermentas, Invitrogen, Carlsbad,
USA
Essigsäure (100 %) Merck, Darmstadt, D
Ethanol, reinst J. T. Baker, Sigma Aldrich,
Taufkirchen, D
Ethanol, vergällt, 96 % Fisher, Saarbrücken, D
Ethidiumbromid Sigma Aldrich, Taufkirchen, D
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Carl Roth, Karlsruhe, D
Ficoll-Paque TM Plus GE Healthcare, Freiburg, D
Fötales Kälberserum (fetal calf serum = FCS) Hyclone, Invitrogen, Carlsbad, USA
Glyzin-Lösung (99,5 %) Carl Roth, Karlsruhe, D
Hyperladder I Bioline, Luckenwalde, D
Interferon-gamma (IFN-γ) Provitro, Berlin, D
Isopropanol Riedel de Häen, Sigma Aldrich,
Taufkirchen, D
Jodacetamid Sigma Aldrich, Taufkirchen, D
Kaliumhydroxid (KOH) Merck, Darmstadt, D
Lipopolysaccharid (LPS,von E. coli) Sigma Aldrich, Taufkirchen, D
Magermilchpulver Carl Roth, Karlsruhe, D
Methanol, reinst Sigma Aldrich, Taufkirchen, D
Mifepriston (RU-486) Sigma Aldrich, Taufkirchen, D
Natriumazid (NaN3) Merck, Darmstadt, D
Natriumchlorid (NaCl) Carl Roth, Karlsruhe, D
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4 x H2O) Merck, Darmstadt, D N-Diluent (Verdünnungspuffer für
Nephelometrie)
Siemens Healthcare, Erlangen, D
Octagam® (5 %) Octapharma, Langenfeld, D
Oligo(dT)18 Primer Fermentas, Invitrogen, Carlsbad, USA
Papain (10 mg/mL) Sigma Aldrich, Taufkirchen, D
Penicillin/Streptomycin Gibco, Invitrogen, Carlsbad, USA
Perm/Wash-Lösung BD Pharmingen, Heidelberg, D
Photoentwickler Agfa, Leverkusen, D
Photofixierer Agfa, Leverkusen, D
Ponceau S Carl Roth, Karlsruhe, D
Prestained Pageruler Protein Plus ladder Fermentas, Invitrogen, Carlsbad, USA
QuantiFast™ SYBR® Green Roche, Mannheim, D
RevertAid™Reverse Transkriptase (200 U/µL) Fermentas, Invitrogen, Carlsbad, USA
RiboLock™RNase Inhibitor (40 U/µL) Fermentas, Invitrogen, Carlsbad, USA
Roti®-Quant 5 x Carl Roth, Karlsruhe, D
Rotiphorese® NF Acrylamid (37,5 : 1) Carl Roth, Karlsruhe, D Rotiphorese® SDS-Laufpuffer, 10x Carl Roth, Karlsruhe, D RPMI 1640-Medium (enthält 2 mM stabiles
Glutamin)
PAN Biotech, Aldenbach, D
Salzsäure (10 N, rauchend) Fluka, Sigma Aldrich, Taufkirchen, D
Sandoglobulin® (5 %) CSL Behring, Marburg, D
Taq-Polymerase Fermentas, Invitrogen, Carlsbad,
USA
Tetramethylethylendiamin (TEMED) Carl Roth, Karlsruhe, D Trichloressigsäure (TCA) Applichem, Darmstadt, D
TRIS-HCl Carl Roth, Karlsruhe, D Trishydroxymethylaminomethan (TRIS) Carl Roth, Karlsruhe, D
Trypanblau Carl Roth, Karlsruhe, D
Tumonekrosefaktor alpha (TNF-α) CellSystems, St. Katharinen, D
Tween20 Merck, Darmstadt, D
β-Mercaptoethanol Carl Roth, Karlsruhe, D
1.2 Verbrauchsmaterial
0,2 mL-Reaktionsgefäße GreinerBioOne, Frickenhausen, D
0,5 mL-Reaktionsgefäße Nerbe Plus, Winsen/Luhe, D
1,5 mL-Reaktionsgefäße Sarstedt, Nümbrecht, D
Amicon Ultra-15 (Ultrafiltrationseinheiten) Millipore, Schwalbach/Taunus, D Cellstar® 75 cm2 Zellkulturflaschen GreinerBioOne, Frickenhausen, D Cellstar® Plastikpipetten (5, 10, 25 mL) GreinerBioOne, Frickenhausen, D Cellstar® TC-Platte mit 96 Vertiefungen,
U-Form
GreinerBioOne, Frickenhausen, D Cellstar® Zellkulturplatte mit 24 Vertiefungen GreinerBioOne, Frickenhausen, D Cellstar® Zellkulturplatte mit 6 Vertiefungen GreinerBioOne, Frickenhausen, D CryoTubeTM Einfrierröhrchen (1,8 mL) Nunc, Langenselbold, D
FACS-Messröhrchen (0,5 mL) Sarstedt, Nümbrecht, D Falcon-Gefäße (15, 25 mL) Becton Dickinson (BD),
Heidelberg, D
Gewebekulturschalen mit Nocken (94 mm) GreinerBioOne, Frickenhausen, D Halbmikro-Küvetten (d = 10 mm) VWR, Darmstadt, D
HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR Säule Pharmacia/GE Healthcare, Freiburg, D
HiTrap Protein A HP-Säule (5 mL) Pharmacia/GE Healthcare, Freiburg, D
HiTrap Protein G HP-Säule (5 mL) Amersham Biosciences, GE Healthcare, Freiburg, D Hybond ECL Nitrozellulose Membran Biorad, München, D Mikrotestplatte mit 96 Vertiefungen, flacher
Boden, unsteril
Sarstedt, Nümbrecht, D Minisart Sterilfilter (Ø 0,45 µm; 0,2 µm) Sartorius, Göttingen, D
NAb™ Protein L Spin Column (5 mL) Pierce/Perbio Science, Bonn, D Neubauer improved Zählkammer Brand, Wertheim, D
Polykarbonat-Kapillaren für LightCycler Genaxxon, Ulm, D
Protean Blotpapier Biorad, München, D
Servapor-Dialyseschlauch (Ø: 16 mm) Serva, Heidelberg, D
1.3 Geräte
ÄKTA™ FPLC Pharmacia/GE Healthcare,
Freiburg, D
AutoMACS Miltenyi Biotec, Bergisch
Gladbach, D
BN ProSpec® (Photometer für Nephelometrie) Siemens Healthcare, Erlangen, D Consort EV231 (Spannungsquelle) Sigma Aldrich, Taufkirchen D Cylcer T personal (PCR-Cycler) Biometra, Göttingen, D
FACS Calibur (Durchflußzytometer) Becton Dickinson, Heidelberg, D Hettich Universal 32 R Tischzentrifuge Hettich, Tuttlingen, D
Image Master VDS (Geldokumentationssystem) Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Freiburg, D
Inverses Lichtmikroskop MBL 3100 Krüss Optronic, Hamburg, D LightCycler (Realtime-PCR Cycler) Roche, Mannheim, D
MiniProtean TetraCell Biorad, München, D
MultiskanEx Thermo Fisher Scientific,
Langenselbold, D My Cycler (Thermal Cycler) Biorad, München, D
Peristaltikpumpe P-1 Pharmacia Biotech, GE Healthcare,
Freiburg, D
pH-Meter CG 820 Schott, Mainz, D
Pipettierhilfe (Pipet Boy) Integra Biosciences, Fernwald, D
Präzisionswaage Fischer Waagen, Goslar, D
SmartSpec Photometer Biorad, München, D
Sterilbank (ClassII Type A/B3) Nuaire, Plymouth, USA
Stickstofftank Air Liquide, Düsseldorf, D
Sysmex KX-21N Sysmex, Norderstedt, D
Thermomixer Comfort Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, D
TransBlot SD Semidry Biorad, München, D
1.4 Biochemische und Molekularbiologische Kits
CD14+-Beads Miltenyi Biotec, Bergisch
Gladbach, D
Nucleospin RNA II Kit Macherey-Nagel, Düren, D
ProteoJET Cytoplasmic and Nuclear Protein Isolation Kit
Fermentas, Invitrogen, Carlsbad, USA
ProteoJET Membrane Protein Isolation Kit Fermentas, Invitrogen, Carlsbad, USA
QIAquick DNA extraction Kit Qiagen, Hilden, D
Quantikine human BAFF/BlyS ELISA R&D Systems, WI-Nordenstadt, D Supersignal® West Pico Chemiluminescent
Substrate
Biorad, München, D
1.5 Zelllinien
Tab. 1: verwendete Zelllinien
Name Zelltyp Bezugsquelle
U937 Histiozytisches Lymphom, Human
AG Prof. K. T. Preissner, Abteilung Biochemie des Uniklinikums Giessen
HL-60 Akute myeloide Leukemie, Human
THP-1 Akute monozytäre Leukemie, Human
1.6 Antikörper
1.6.1 Primärantikörper
BAFF Kaninchen anti human, polyklonal
AbD serotec, Düsseldorf, D BAFF
(Atto488)
Ratte anti human, monoklonal Axxora, Lörrach, D
Calnexin Maus anti human, monoklonal Sigma Aldrich, Taufkirchen, D CD 14
(PerCP-Cy5.5)
Maus anti human, monoklonal BD Pharmingen, Heidelberg, D GAPDH Maus anti human, monoklonal Millipore, Schwalbach/Taunus, D Histon H4 Maus anti human, monoklonal Cell Signaling, NEB, Frankfurt, D Isotyp
(Atto488)
Ratte IgG2a Axxora, Lörrach, D
Isotyp (PerCP-Cy5.5)
Maus IgG2b BD Pharmingen, Heidelberg, D
β-Tubulin Maus anti human, monoklonal Sigma Aldrich, Taufkirchen, D 1.6.2 Sekundärantikörper
Ziege anti Kaninchen (HRP) Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, D
Esel anti Maus (HRP) Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg, D
1.7 Primer
Tab. 2: verwendete Primer
Bezeichnung Nukleotidsequenz
CD16_603f 5‟-TGTCAACCATCTCATCATTC-3‟
CD16_770r 5‟-GAGGGTCCTTTCTCCATTT-3‟
CD32b_421f 5‟-CTTTCTGAGTGGCTGGTG-3‟
CD32b_598r 5‟-GGTTTGCTTGTGGGATGGA-3‟
CD64_39f 5‟-AGTTGATGGGCAAGTGGAC-3‟
CD64_203r 5‟-GTGATTCTGTAGCTGGGG-3‟
BAFF_277f 5‟-CTCCCACGGAAGGAAAGCC-3‟
BAFF_522r 5‟-TCTGGACCCTGAACGGCAC-3‟
BAFF_319f 5‟-CACGGTGGTGTCTTTCTAC-3‟
BAFF_494r 5‟-GAGCTGGTGGTTCAAAGAT-3‟
GAPDH_f 5‟-GGAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3‟
GAPDH_r 5‟-ATCTGCCGTCCAGTCCAGGTG-3‟
GAPDH_537f 5‟-GATCATCAGCAATGCCTCC-3‟
GAPDH_697r 5‟-CATCAGCCACAGTTTCCC-3‟
Alle in dieser Arbeit verwendeten Primer basieren auf Sequenzen humanen Ursprungs.
1.8 Software
ÄKTA™ Unicorn Pharmacia/GE Healthcare, Freiburg, D
Ascent ThermoFisher Scientific, Langenselbold, D
CellQuest® BD Pharmingen, Heidelberg, D
WinMDI The scripps research institute, La Jolla,
CA, USA
PrimerPremier Premier Biosoft, Palo Alto, CA, USA
LightCycler®, Version 1.5 Roche, Mannheim, D
GraphPad Prism GraphPad Software, La Jolla, CA, USA
ImageJ NIH, Bethesda, MD, USA
Promoter Database CSHL, Cold Harbor, NY, USA