Lokalisation der nNOS positiven Strukturen im mesenterialen Gefäßbett

Um eine mögliche Erklärung für die gesteigerte PNS-induzierte Vasodilatation und die endothelunabhängige Hyporeaktivität gegenüber Vasokonstriktoren bei PVL-Tieren zu finden, wurde im Folgenden die Proteinmenge der nNOS im mesenterialen Gefäßbett untersucht. Dazu wurde sowohl von PVL- als auch von Sham-Tieren mesenteriales Gefäßbett entnommen, in Formaldehyd und Saccharose fixiert und schließlich in 5-10 µM dünne Präparate geschnitten.

Mittels eines nNOS-spezifischen Antikörpers, der keine Kreuzreaktion mit iNOS oder eNOS zeigte, wurde zum einen die Proteinmenge und zum anderen die Lokalisation der nNOS (Abb.

24A) im mesenterialen Gefäßbett untersucht. Als Indikator für die nNOS-Proteinmenge konnte die Intensität der roten Farbe verwendet werden (Abb. 24B bis 24D).

In Abbildung 24A ist die Lokalisation der Fasern mittels Immunfluoreszenz gegen nNOS exemplarisch dargestellt. Es handelt sich um einen Querschnitt eines mesenterialen Gefäßes.

Leuchtend rot und an einigen Stellen mit Pfeilen gekennzeichnet kann man die nNOS-positiven Fasern erkennen. Das Lumen des Gefäßes war noch mit Resten von Erythrozyten gefüllt. Die entsprechende Isotypkontrolle mit einem anti-Maus IgG2a Antikörper war negativ (nicht gezeigt).

Vor allem in den äußeren Bereichen der Gefäße, in der Adventitia und an der Grenze von

68 Ergebnisse Adventitia und Media, waren große Fasern positiv angefärbt (Abb. 24A). Wesentlich dünnere und nur schwer darstellbare Fasern wurden auch in der Media identifiziert (Abb. 24A). Hierbei handelt es sich offenbar um die Endigungen der nNOS-positiven Fasern, da keine weiteren Verzweigungen ausgemacht werden konnten.

Abb. 24A: Färbung der nNOS mittels Immunfluoreszenz. Das hier in 400-facher Vergrößerung dargestellte Gefäß einer PVL-Ratte ist eine Arterie der zweiten Ordnung im mesenterialen Gefäßbett und wurde mittels nNOS-spezifischen Antikörper und fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper angefärbt. Die kleinen, dickeren Pfeile deuten auf nNOS-positive Fasern, die vor allem in der Adventitia lokalisiert sind. Nur schwer zu erkennen sind auf diesem Bild die dünnen Fasern in der Media, die die Endigungen von nNOS-positiven Fasern darstellen.

Für die Untersuchungen der nNOS-Proteinmenge wurde der gleiche nNOS-Antikörper verwendet wie für die Immunfluoreszenz, allerdings wurde jetzt für die Anfärbung das Alkaline-Phosphatase-Anti-Alkaline-Phosphatase Kit (APAAP) von Dako verwendet.

Es zeigte sich, dass sich die Intensität der Färbung zwischen der Arteria mesenterica superior und den Gefäßen der zweiten Ordnung im Gefäßbett nicht unterschied (nicht gezeigt). In den weiter distal gelegenen Gefäßen jedoch nahm die Intensität der Rotfärbung stetig ab, so dass im kapillären Gefäßbett keine nNOS mehr nachgewiesen werden konnte (nicht gezeigt). Zwischen den Gefäßen der beiden Tiergruppen, PVL und Sham, zeigte sich jedoch ein deutlicher

69 Ergebnisse Unterschied. Die Intensität der Rotfärbung ist bei PVL- deutlich ausgeprägter als bei Sham-Ratten (Abb. 24B und 24C), was auf eine erhöhte nNOS-Proteinmenge bei den PVL-Tieren hindeutet. Die Isotypkontrolle war, abgesehen von wenigen unspezifischen Bindungen, negativ (Abb. 24D).

Abb. 24B: Sham-Tier mit nNOS-spezifischer APAAP Färbung. Es zeigte sich vor allem in der Adventitia dieses 200-fach vergrößerten Gefäßes eine spezifische Färbung. Die Media und auch das Endothel waren nNOS-negativ.

70 Ergebnisse

Abb. 24C: Gefäß einer PVL-Ratte. Das hier in 200-facher Vergrößerung gezeigte Gefäß wurde durch einen nNOS-spezifischen Primärantikörper, und durch die Verwendung des APAAP-Kits, rot angefärbt. Im Vergleich zu der Anfärbung in den Kontrolltieren (Abb. 24B) war die rote Farbe insbesondere in der Adventitia deutlich intensiver.

In der Media war nur eine schwache Rotfärbung zu erkennen, wohingegen im Endothel keine nNOS nachgewiesen werden konnte.

Abb. 24D: Isotypkontrolle. Die 200-fach vergrößerte Isotypkontrolle war, abgesehen von ein paar wenigen unspezifischen Bindungen des Primärantikörpers, negativ. Als Isotypkontrolle wurde ein anti-Maus IgG2a

verwendet.

71 Ergebnisse 5.1.5 Bestimmung der nNOS Proteinmenge

Da eine Quantifizierung der nNOS-Proteinmenge durch immunhistochemische Methoden in den verschiedenen Tiergruppen nur schwer zu realisieren war, wurde ein Western Blot durchgeführt.

Dazu wurde eine Probe von mesenterialem Gefäßbett entnommen und homogenisiert. Dieses Gewebelysat wurde dann in einer Proteinkonzentration von 50 µg auf ein SDS-Gel aufgetragen und somit die Proteine ihrer Größe entsprechend aufgetrennt. Im Anschluss wurde das Gel geblottet und die Banden mittels des schon in der Immunhistologie verwendeten nNOS-Antikörpers, in Kombination mit dem ECL-Kit, detektiert. Um zu zeigen, dass die iNOS keine Rolle bei der NO-Synthese im Gefäßbett spielt, wurde zusätzlich ein Western Blot gegen die iNOS durchgeführt. In Abbildung 25A ist ein exemplarischer Western Blot für nNOS und iNOS dargestellt. Als Positivkontrollen wurden zum einen Hypophysenlysat der Ratte (nNOS-155 kDa) und zum anderen mit LPS und IFNγ stimulierte Mausmakrophagen (iNOS-130 kDa) verwendet.

neg. pos.

Sham Kontr Kontr. PVL

← nNOS (155 kDa)

← iNOS (135 kDa)

Abb. 25A: n/iNOS Western Blot von mesenterialem Gefäßbett. In dieser Abbildung ist ein exemplarischer nNOS- bzw. iNOS Western Blot dargestellt. Mesenteriales Gefäßbett wurde aus beiden Tiergruppen entnommen, homogenisiert und dann in gleichen Proteinkonzentrationen auf das Gel aufgetragen. Die Detektion der n/iNOS Proteine erfolgte mit einem spezifischen Antikörper in Kombination mit einem ECL-Kit.

Als Positivkontrolle wurde für nNOS ein Hypophysenlysat aus Ratten verwendet und für iNOS wurden mit IFNγ+LPS stimulierte Mausmakrophagen eingesetzt.

Abkürzungen: Sham=kontrolloperierte Tiere; PVL=portalvenös ligierte Tiere

Um schließlich auch eine quantitative Aussage über die nNOS-Proteinmenge machen zu können, wurden die nNOS-Banden von beiden Tiergruppen densitometrisch vermessen. In Abbildung 25B ist dies grafisch dargestellt. Es zeigte sich, dass im mesenterialem Gefäßbett von PVL-Tieren ca. zwölfmal mehr nNOS-Protein vorhanden war als bei den Kontrolltieren (Abb. 25B).

Die Werte im Einzelnen: Sham: 144 ± 60 vs. PVL: 1739 ± 341. (p<0,05).

72 Ergebnisse

0 1000 2000 3000

Dichte (Volumen)

Sham PVL

p<0,05

Abb. 25B: Densitometrische Auswertung der Western Blots für n/i NOS. Die Western Blots wurden densitometrisch vermessen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. (Sham: n=6; PVL: n=7). Die p-Werte wurden mittels Mann-Whitney bestimmt.

Abkürzungen: Sham=kontrolloperierte Tiere; PVL=portalvenös ligierte Tiere