Lineblot-Analyse der Immunantwort bei mit Oozysten infizierten Hühnern

In Zusammenarbeit mit S. Buschtöns aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. A. Tenter von der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo) wurden Seren von Hühnern untersucht, die im Alter von sieben bis acht Wochen experimentell mit T. gondii Oozysten des DX-Stammes (Typ II) infizierten worden waren. Die Tiere wurden aufgrund der unterschiedlichen Inokulationsdosen von 10¹ bis 10⁷ Oozysten in sieben Gruppen eingeteilt. Jede Gruppe bestand aus vier Tieren und von jedem Tier wurden Seren von Tag 3 bis 86 nach Infektion auf die Anwesenheit von spezifischen IgY-Antikörpern im Lineblot untersucht. Das Immunoglobulin Y der Hühner ähnelt funktionell dem IgG, ist jedoch dafür bekannt, dass dieses weniger Kreuzreaktionen mit Säugetierproteinen aufweist. Als Negativkontrolle wurde von jedem Huhn eine Serumprobe vor der Infektion (0 dpi) entnommen. Um eine mögliche Kontamination mit im Boden lebenden Mikroorganismen zu vermeiden, wurden die Hühner für die Versuchsdurchführung in Käfigen gehalten.

Die Lineblot-Analyse erfolgte in Göttingen unter der Verwendung der rekombinanten Antigene BAG1, MAG1, MIC5, SAG4, SAG1, ROP1, GRA9 und GRA1. Das MAG1 wurde von der Firma Mikrogen (Neuried) zur Verfügung gestellt. Für den Lineblot wurde 1 µg des jeweiligen Antigens/Membran verwendet und die jeweilige Immunreaktion mit spezifischen IgY-Antikörpern nachgewiesen.

Zur Darstellung der Lineblot-Analysen wurden für diese Arbeit vier Tiere ausgesucht, die mit einer unterschiedlichen Inokulationsdosis infiziert wurden (Abb. 3.18). Dabei konnte im Lineblot eine vom Alter des Tieres abhängige Zunahme unspezifischer Immunreaktionen beobachten werden. Des Weiteren scheint die humorale Immunantwort von Tieren verschiedener Gruppen unterschiedlich und unabhängig von der Infektionsdosis auf die rekombinanten Antigene zu reagieren. Dieses ist u. a. bei dem Nachweis MIC5-spezifischer IgY-Antikörper zu beobachten. Die Immunantwort gegen andere Antigene, wie z. B. das rROP1-Antigen, zeigte eine Abhängigkeit von der Infektionsdosis. Dabei konnte bei einer Zunahme der Infektionsdosis eine kurzzeitige Erhöhung ROP1-spezifischer IgY-Antikörper zu früheren Zeiten p. i. festgestellt werden.

Wie bei den Puten, zeigte auch das rGRA1-Antigen bei den Hühnern nur geringe immunogene Eigenschaften. Eine positive Immunantwort zeigten vor allem Hühner mit einer hohen Infektionsdosis etwa 7-10 Tage nach der Infektion.

Abb. 3.18: Lineblot-Analyse mit Seren von experimentell infizierten Hühnern

Experimentell wurden Hühner mit einer Infektionsdosis von 10¹ bis 10⁷ Oozysten mit T. gondii infiziert. Die IgY-Immunantwort der Hühner wurde im Lineblot-Assay unter Verwendung der acht rekombinanten Antigene untersucht. Dargestellt ist jeweils die IgY-Immunantwort eines Huhns mit einer Infektionsdosis von 10¹, 10³, 10⁴ bzw. 10⁷ Oozysten. Die Detektion Antigen-spezifischer IgY-Antikörper fand durch Inkubation der Blotstreifen mit einem 1:500 verdünnten Serum und einem 1:2.000 verdünnten HRP-konjugierten anti-Huhn IgY (IgG) (H+L)-Sekundärantikörper statt.

Untersucht wurden Verlaufseren zu den angegebenen Tagen nach Infektion (dpi). Die Entwicklungszeit der Lineblots betrug 200 sec.

Für eine weitere Untersuchung wurden die Lineblots basierend auf den 8-bit *.tif-Dateien mit Hilfe des ImageJ-Programms nach einer Entwicklungszeit von 200 sec ausgewertet.

Bei Verwendung der rekombinanten Antigene MIC5, GRA9 und GRA1 zeigten die Hühner mit einer Infektionsdosis von 10⁷, 10⁶ und 10⁴ eine Dosis-abhängige IgY-Immunantwort (Abb. 3.19). Dabei waren die IgY-IgY-Immunantworten der Hühner einer Gruppe ähnlich. Des Weiteren stieg mit Zunahme der Inokulationsdosis der Antikörper-Index, und somit die Menge an IgY-Antikörpern im Serum. Außerdem ist eine Verschiebung der maximalen Immunantwort zu einem früheren Zeitpunkt nach der Infektion zu beobachten. Die Untersuchung von Hühnern mit einer niedrigeren Inokulationsdosis zeigte nur teilweise eine Dosis-abhängige Reaktion. Dabei war die Immunantwort der Hühner einer Gruppe oft unterschiedlich. Eine

Infektionsdosis-abhängige Immunantwort war auch unter Verwendung der anderen hier eingesetzten Antigene zu beobachten.

Bei dem Nachweis Antigen-spezifischer IgY-Antikörper zeigte sich außerdem, dass viele Tiere zu Beginn einer Infektion eine starke humorale Immunantwort entwickelten, die sich dann kurzzeitig abschwächte, um dann am Tag 63 bis 86 nach Infektion wieder anzusteigen.

Abb. 3.19: Infektionsdosis-abhängige Immunantwort von Hühnern

Hühner mit einer Infektionsdosis von 10⁴, 10⁶ und 10⁷ Oozysten pro Tier wurden im Lineblot auf die Anwesenheit von MIC5-, GRA9- und GRA1-spezifische IgY-Antikörper untersucht. Die Entwicklungszeit betrug 200 sec. Anschließend erfolgte die Quantifizierung mit dem ImageJ-Programm. Von jeder Gruppe wurden vier Tiere getestet, wobei jede Farbe ein Tier repräsentiert.

Um die spezifischen Immunantworten besser miteinander vergleichen zu können, wurde von der Antikörperantwort jeder Gruppe der Mittelwert zu jedem Untersuchungszeitpunkt berechnet. In einer dreidimensionalen Darstellung wurden die mittlere Antikörper-Index für jedes Antigen und jedem Untersuchungszeitpunkt gruppenabhängig dargestellt (Abb. 3.20). Hühner mit einer Infektionsdosis von 10⁷ Oozysten pro Tier besaßen eine insgesamt höhere IgY-Immunantwort als die anderen Gruppen. Bei nur geringen Infektionsdosen (10¹ und 10² Oozysten pro Tier) war der Unterschied in der Immunantwort dagegen nur sehr schwach bzw. nicht signifikant ausgeprägt.

Abb. 3.20: Dreidimensionale Darstellung der humoralen Immunantwort von Hühnern gegen definierte Toxoplasma-Antigene

Die Hühner wurden experimentell mit einer Infektionsdosis von 10¹ bis 10⁷ Oozysten pro Tier mit T. gondii infiziert. Nach einer Analyse im Lineblot-Assay unter der Verwendung rekombinanter Antigene wurden die Lineblots nach einer Entwicklungszeit von 200 sec mit Hilfe des ImageJ-Programms quantitativ ausgewertet. Von den vier Hühnern einer Gruppe sind jeweils die Mittelwerte zu den angegebenen Zeitpunkten dargestellt.

3.6.2.1 Reproduzierbarkeit der Lineblot-Assay Ergebnisse

Um die Reproduzierbarkeit des Lineblot-Assays zu beurteilen wurden drei unabhängige Experimente mit Seren von infizierten Hühner durchgeführt. Zum einen wurden die Ergebnisse des in 3.6.2 gezeigten Versuches verwendet. Bei der zweiten Untersuchung wurde ebenfalls 1 µg Antigen/Membran aufgetragen, jedoch wurde eine andere Fraktion des jeweiligen Antigens benutzt. Die Serum- und Sekundärantikörperverdünnungen blieben dabei unverändert. In der dritten Untersuchung wurden dieselben Antigenelutionen wie in Versuch 2 verwendet, die Serumverdünnung wurde von 1:500 auf 1:200 herabgesetzt und die Antiserumverdünnung von 1:2.000 auf 1:5.000 heraufgesetzt. Nach einer Entwicklungszeit der Lineblots von 200 sec wurden diese mit Hilfe des ImageJ-Programms ausgewertet. Dabei ist in Abbildung 3.21 gezeigt, dass nur geringe Unterschiede in der Intensität bestehen, die Titerverläufe jedoch unverändert blieben.

Abb. 3.21: Dreifach-Untersuchung von Hühnerseren im Lineblot

Von jeder Gruppe wurden Verlaufseren von einem Huhn durch drei Untersuchungen im Lineblot auf Reproduzierbarkeit der Ergebnisse getestet. Durch eine Quantifizierung mit dem ImageJ-Programm wurden die Antikörper-Indices ermittelt.

Durchlauf 1: Antigen-Elution (1) / Serum 1:500 / Antiserum 1:2.000 Durchlauf 2: Antigen-Elution (2) / Serum 1:500 / Antiserum 1:2.000 Durchlauf 3: Antigen-Elution (2) / Serum 1:200 / Antiserum 1:5.000