Alle Kultivierungen von E. coli wurden bei 37°C durchgeführt, wenn nicht anders spezifisch vermerkt. Um das Zellwachstum zu kontrollieren, wurde die optische Dichte bei 600 nm (OD600) mit Hilfe des Ultrospec 2100 pro Photometers (Amersham Biosciences) bestimmt.
Bei Bedarf wurden den Kulturen zur Selektion Antibiotika zugesetzt: 100 µg*mL-1 (Ampicillin, Carbenicillin), 50 µg*mL-1 (Kanamycin, Spectinomycin) and 34 µg*mL-1 (Chloramphenicol). Feste Nährböden wurden durch Zugabe von 1,5% (w/v) Agar hergestellt.
4.3.1 Medien
Lysogeny broth- (LB) Medium [Komplexmedium, (Maniatis & Fritsch, 1982)]
1% (w/v) Trypton 1% (w/v) NaCl
0,5% (w/v) Hefeextrakt (pH 7,0)
KE-Minimalmedium (Epstein & Kim, 1971)
Stammlösung: Gepuffert mit 100 mM Kalium-Phosphatpuffer auf pH 5,8 oder pH 7,6 0,58 g*L-1 Trinatriumcitrat
1,06 g*L-1 Ammoniumsulfat
33
Zusätze: Kohlenstoffquelle: Effektor:
0,4 mM MgSO4 0,2% (w/v) Glucose oder 10 mM L-Lysin Monohydrochlorid 6 µM FeSO4 0,2% (w/v) Fructose
Die Stammlösung, Zusätze, C-Quellen und der Effektor wurden jeweils getrennt angesetzt und autoklaviert bzw. steril filtriert. Unmittelbar vor Gebrauch wurde die Stammlösung mit den Zusätzen angereichert und mit der entsprechenden C-Quelle und dem Effektor versetzt.
M9-Minimalmedium (Miller, 1992)
Stammlösung: Zusätze: Kohlenstoffquelle:
(5-fach konzentriert) 0,1 mM CaCl2 0,4% (w/v) Maltose 64 g*L-1 Na2HPO4 x 7H2O 2 mM MgSO4
15 g*L-1 KH2PO4
2,5 g*L-1 NaCl 5 g*L-1 NH4Cl (pH 7,0)
Die Stammlösung, Zusätze und C-Quelle wurden jeweils getrennt angesetzt und autoklaviert bzw. steril filtriert. Unmittelbar vor Gebrauch wurde die Stammlösung mit den Zusätzen angereichert (erweitertes M9-Minimalmedium, eM9) und mit Maltose versetzt.
Super optimal broth with catabolite repression- (SOC)-Medium (Hanahan, 1983)
20 g*L-1 Trypton 5 g*L-1 Hefeextrakt 0,5 g*L-1 NaCl 0,95 g*L-1 MgCl2
0,186 g*L-1 KCl 3,96 g*L-1 Glucose (pH 7,0)
4.3.2 Bestimmung der CadC-vermittelten Signaltransduktion in vivo
Für in vivo Bestimmungen der β-Galaktiosidaseaktivität als Maß für die cadBA Expression wurden die Vorkulturen (VK) in 5 mL KE-Medium pH 7,6 plus 0,2% (w/v) Glucose aerob über Nacht im Roller inkubiert. Für die mikroaeroben Hauptkulturen (HK) wurden die Bakterien in KE-Medium pH 7,6 und pH 5,8, supplementiert mit und ohne 10 mM Lysin, auf ein optische Dichte von ~0,05 angeimpft und in maximal gefüllten 10 mL-Greiner-Röhrchen vorsichtig auf einer Wippe geschwenkt (2 rpm), um ein Sedimentieren der Zellen zu vermeiden. Nach Kultivierung bis zu einer OD600 von 0,3-0,5 wurde 1 mL der Zellen in einem 2 mL Eppendorf-Röhrchen mittels Zentrifugation (10 min, 13.200 rpm, 4°C, Eppendorf 5415R) geerntet. Bis zur Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität wurden die Zellpellets bei -20°C aufbewahrt.
34 Um den Effekt von erhöhten LysP-Mengen unter induzierenden Bedingungen (pH 5,8 plus 10 mM Lysin) auf die CadC-vermittelte cadBA Expression zu untersuchen, wurde bei den korrepondierenden HK 0,2% (w/v) Fructose als C-Quelle verwendet und die Expression von lysP während der kompletten Kultivierungsdauer mit 0,2% (w/v) Arabinose (da pBAD33-basiert) induziert.
Für die Analyse der Abhängigkeit der cadBA Expression von der externen Lysinkonzentration wurde die HK von E. coli MG-CR in KE-Medium pH 5,8 plus 0,2% Glucose in Gegenwart von steigenden Lysinkonzentrationen (0-128 mM) kultiviert.
4.3.3 Lysintransportassay mit intakten Zellen
Für die Messung von aktivem Lysintransport wurden VK von E. coli JWCD247 nach Transformation mit Plasmiden, kodierend für die gewünschten LysP-Varianten, in LB-Medium aerob über Nacht im Roller inkubiert. Diese Übernachtkulturen wurden 70-fach mit 50 mL frischem LB-Medium verdünnt und aerob im Schikane-Erlenmeyerkolben auf dem Schüttler (200 rpm) bis zu einer OD420 von 1,0 kultiviert (HK). Nach Ernte durch Zentrifugation (10 min, 10.000 rpm, 4°C, Eppendorf 5804R) wurden die Zellen mit 100 mM Tris/2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) -Puffer (pH 7,6, 5 mM MgCl2) 1x gewaschen.
Das Pellet wurde in so viel Volumen des gleichen Puffer resuspendiert (aufkonzentriert), so dass eine Gesamtproteinkonzentration von 0,35 mg*mL-1 (entspricht einer OD420 von ~5,0) eingestellt wurde. Die Zellen wurden unmittelbar für die in vivo Transportmessungen verwendet.
4.3.4 In vivo Protein-Protein-Interaktionsstudie
Für β-Galaktosidase Messungen wurde E. coli BTH101 mit Plasmiden, kodierend für die entsprechenden T18- und T25-Fusionsproteine, co-transformiert. Die VK wurden in 5 mL LB-Medium, versetzt mit 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG), aerob im Roller bei 30°C über Nacht inkubiert. Mit diesen Bakterienkulturen wurde die gleiche Medienkomposition (5 mL HK) auf eine OD600 von ~0,05 inokuliert und unter Aerobiose im Roller bei 30°C bis zu einer OD600 von 0,3-0,5 kultiviert. Dann wurde 1 mL der HK-Kultur in einem 2 mL Eppendorf-Röhrchen mittels Zentrifugation (10 min, 13.200 rpm, 4°C, Eppendorf 5415R) geerntet und bis zur Weiterverwendung bei -20°C gelagert.
Um den Einfluss von externem Lysin und pH auf die CadC/LysP- und LysP/LysP-Interaktion zu testen, erfolgte die Kultivierung der Übernacht-VK von BTH101, co-transformiert mit pUT18C-lysP/pKT25-cadC, pUT18C-lysP/pKT25-lysP bzw. pUT18C-zip/pKT25-zip
35 (Kontrolle), aerob bei 30°C in 5 mL LB-Medium supplementiert mit 0,5 mM IPTG. Diese Bakterienkulturen wurden dann in KE-Medium pH 7,6 und pH 5,8 (plus 0,2% Glucose), supplementiert mit variierenden Lysinkonzentrationen (0-128 mM) und 0,5 mM IPTG, auf eine OD600 von ~0,05 angeimpft und in maximal gefüllten 10 mL-Greiner-Röhrchen bei 30°C vorsichtig auf einer Wippe geschwenkt (2 rpm), um mikroaerobe Bedingungen zu garantieren und ein Sedimentieren der Zellen zu vermeiden. Nach Kultivierung bis zu einer OD600 von 0,3-0,5 wurde 1 mL der Bakteriensuspension in einem 2 mL Eppendorf-Röhrchen mittels Zentrifugation (10 min, 13.200 rpm, 4°C, Eppendorf 5415R) geerntet und bis zur Weiterverwendung bei -20°C gelagert.
Anhand von Komplementationsstudien mit dem malE-defizienten E. coli Stamm MM39 nach Transformation mit Plasmiden kodierend für die MBP (engl. maltose-binding protein)-Hybridproteine fusioniert an T25 wurde überprüft, ob die MBP-Hybridkonstrukte in adäquaten Mengen exprimiert und korrekt in die Zytoplasmamembran inseriert wurden.
Dabei wurde das Wachstum der Bakterien auf eM9-Minimalmedium-Agarplatten mit 0,4%
(w/v) Maltose als einzige C-Quelle überprüft.
4.3.5 Rolle der LysP-Menge bei der Lysin-Co-Sensorik
Für die fluoreszenzmikroskopische Verifizierung der Biosynthese und Insertion des LysP-eGFP-Fusionsproteins in die Zytoplasmamembran von E. coli MG-MR1 erfolgte die VK der Bakterien in 5 mL KE-Medium pH 7,6 plus 0,2% Glucose aerob über Nacht im Roller. Damit wurde die 5 mL HK mit derselben Komposition auf eine OD600 von ~0,05 angeimpft und unter Aerobiose im Roller bis zu einer OD600 von 0,3-0,5 inkubiert. Ein Aliquot dieser Bakteriensuspension wurde sofort auf einen Objektträger mit Agarpad aufgetropft und mikroskopisch analysiert.
Für die Quantifizierung der CadC- und LysP-Mengen unter induzierenden und nicht induzierenden Bedingungen wurde eine 5 mL VK von MG-MR1 in KE-Medium pH 7,6 plus 0,2% Glucose aerob über Nacht im Roller kultiviert. Damit wurde eine 50 mL Tageskultur (KE-Medium pH 7,6 plus 0,2% Glucose) im Schikane-Erlenmeyerkolben 1%ig inokuliert und unter Schütteln (200 rpm) aerob inkubiert. Mit dieser Kultur wiederum wurden 2x1 L KE-Medium pH 7,6 versetzt mit 0,2% Glucose in großen 2 L-Schikane-Erlenmeyerkolben erneut 1%ig überimpft und über Nacht im Schüttler (200 rpm) unter Aerobiose bis zum Erreichen der stationären Phase kultiviert. Nach Aufteilung der 2 L-Kultur in vier 500 mL Portionen erfolgte die Ernte der Zellen via Zentrifugation (15 min, 5000 rpm, 30°C, Sorvall® EvolutionRC). Die erhaltenen vier Pellets wurden dann in vier sterilen 500 mL Schottflaschen
36 in vier unterschiedlichen Minimalmediumkompositionen (plus 0,2% Glucose) resuspendiert:
1) pH 5,8 + 10 mM Lysin, 2) pH 5,8 ohne Lysin, 3) pH 7,6 + 10 mM Lysin und 4) pH 7,6 ohne Lysin. Durch einfaches Stehenlassen der Schottflaschen im 37°C-Brutraum wurden die Zellen 1 h mikroaerob inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert (15 min, 5000 rpm, 4°C, Sorvall® EvolutionRC) und die generierten Zellpellets wurden nach Schockfrostung bis zur Verwendung bei -80°C gelagert.
4.3.6 Überproduktion von Proteinen
Alle VK für die im Folgenden aufgelisteten Überproduktions-HK wurden pauschal in LB-Medium in für die Inokulation der HK ausreichenden Volumina aerob über Nacht im Roller/Schüttler (200 rpm) kultiviert. Im Falle von HK 1)-3) wurden die Zellen vor der Ernte 1x mit niederionischen Waschpuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,5 plus 10 mM MgCl2) gewaschen und dann mittels Zentrifugation (10 min, 6000 rpm, 4 °C, Sorvall® EvolutionRC) geerntet. Nach Schockfrostung erfolgte die Lagerung der Pellets bei -80°C. Bei HK 4)-5) wurden die Zellen via Zentrifugation (10 min, 4500 rpm, 4°C, Eppendorf 5804R) geerntet und nach Schockgefrierung bei -20°C oder -80°C verwahrt.
1) Für die Überproduktion von LysP für anschließende Reinigung und Rekonstitution wurde die HK (LB-Medium in 2 L-Schikane-Erlenmeyerkolben) mit Zellen von BL21(DE)pLysS-pT-lysP auf eine OD600 von 0,1 angeimpft und aerob auf dem Schüttler (200 rpm) bis zu einer OD600 von 0,5 inkubiert. Dann erfolgte die Induktion der Genexpression mit 0,5 mM IPTG für 3 h.
2) Für die Überproduktion von CadC für anschließende Reinigung und Co-Rekonstitution wurde die HK (LB-Medium in 2 L-Schikane-Erlenmeyerkolben) mit Zellen von BL21(DE)pLysS-pET16b-cadC2 auf eine OD600 von 0,1 angeimpft und aerob auf dem Schüttler (200 rpm) bis zu einer OD600 von 0,5 inkubiert. Dann erfolgte die Induktion der Genexpression mit 0,5 mM IPTG für 3 h.
3) Für die Überproduktion von eGFP für anschließende Reinigung wurde die HK (LB-Medium in 2 L-Schikane-Erlenmeyerkolben) mit Zellen von BL21(DE)pLysS-pET21a-egfp auf eine OD600 von 0,1 angeimpft und aerob auf dem Schüttler (200 rpm) bis zu einer OD600
von 0,5 inkubiert. Dann erfolgte die Induktion der Genexpression mit 0,5 mM IPTG für 3 h.
4) Für den Nachweis der Biosynthese und Membranintegration von allen T18-/T25-CadC-Varianten in BL21(DE)ΔcadC und der Chimäre T18-LysP-D275A_D278A in BL21(DE)pLysS wurden je 20 mL HK (LB-Medium in 50 mL-Falcons) 1%ig inokuliert und aerob im Schüttler (200 rpm) bei 30°C bis zu einer OD600 von ~2 inkubiert. Anmerkung:
37 Sowohl die entsprechenden VK (Inkubation bei 30°C!), als auch die HK enthielten während der kompletten Kultivierungsdauer 0,5 mM IPTG als Induktor für die Genexpression.
5) Für die Kontrolle der Produktion und Membraninsertion von allen LysP-Varianten (pBAD33-basiert) in EPCD4 und allen CadC-Varianten (pET16b-basiert) in BL21(DE)pLysS wurden 20 mL LB-Medium in 50 mL-Falcons mit 200 µL VK angeimpft und aerob im Schüttler (200 rpm) bis zu einer OD600 von 0,5 kultiviert. Nun wurde die Genexpression durch Zugabe von 0,2% Arabinose (pBAD33) oder 0,5 mM IPTG (pET16b) für 3 h induziert.
4.3.7 Dauerkulturen
Für die längerfristige Lagerung von Bakterienstämmen wurde eine frische aerob inkubierte Übernacht-VK (LB-Medium) mit 17% (v/v) Glycerol versetzt und unmittelbar in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgte bei -20°C oder -80°C.