ZON Zulage Linear (ZON)
5.1 Kritik der Methoden
5.1.1 Versuchsaufbau
Versuchstiere:
Schweine sind in der Praxis besonders von Belastungen mit Zearalenon betroffen, da sie am empfindlichsten auf dieses Mykotoxin reagieren. Neben der Tierart spielt auch das Entwicklungsstadium eine wichtige Rolle. So sind präpubertierende Schweine sensibler gegenüber Zearalenon als Zuchtsauen oder Mastschweine (DROCHNER 1990, DÄNICKE et al. 2000). Aus diesem Grunde werden in den vorliegenden Untersuchungen präpubertierende Schweine als Versuchstiere eingesetzt.
Im Rahmen dieser Studie kann eine vermehrte Krankheitsanfälligkeit nicht beobachtet werden. Untersuchungen von LUSKY et al. (1997) und DÄNICKE et al. (2000), wonach die Aufnahme von mykotoxinbelastetem Futter bei Nutztiere zu einer negativen Beeinflussung des Immunstatus führen könnte, bleiben aufgrund der Beobachtungen dieser Arbeit unbestätigt. Jedoch dauerte die Versuchsperiode im Rahmen dieser Untersuchungen nur maximal 67 Tage, während der Zeitraum bei LUSKY et al. (1997) 90 Tage beträgt. Da die Frage der unspezifischen Wirkungen des Mykotoxins auf den Organismus nicht im Vordergrund steht, ist die gewählte Versuchsdauer nicht nachteilig.
Befürchtungen von DALE (1998), wonach durch sogenannte Mykotoxinbinder auch erwünschte Stoffe, wie z. B. Vitamine, Aminosäuren und Medikamente gebunden und somit
DISKUSSION
Versuchsfutter:
Bei natürlich kontaminierten Futtermitteln besteht durch die lokale Konzentration von Pilzen und Mykotoxinen (sogenannte hot spots) zum Einen das Risiko einer Fehleinschätzung der tatsächlichen Belastung und zum Anderen die Gefahr einer inhomogenen Verteilung des Toxins (MEYER et al. 1997). Aus diesem Grunde erhalten die Versuchstiere in beiden Versuchsabschnitten Zwieback, der mit einer entsprechenden Menge Zearalenonstandard präpariert wird. Um eine unerwünschte zusätzliche Intoxikation zu verhindern, erfolgt eine Untersuchung der Futtermittel und des Zwiebacks auf eine eventuelle Kontamination mit Zearalenon, d. h. mittels des präparierten Zwiebackstücks gelingt es, den Schweinen eine genau definierte Toxinmenge zu zuführen..
Um die Versuchsbedingungen so praxisnah wie möglich zu halten, wird das eingesetzte Mykotoxin in beiden Versuchsabschnitten oral verabreicht, d. h. durch präparierte Zwiebackstücke an die Tiere verfüttert. Auf eine sicherlich einfacher durchführbare und in Bezug auf die vollständige Aufnahme sicherere Applikationsmethode, wie z. B. die subkutane Injektion des Toxins wird verzichtet, da eine eventuelle Zearalenonbindung durch Zeolith nur durch das Zusammentreffen der beiden Substanzen (im Magen-Darm-Trakt) überhaupt möglich sein könnte.
Versuchsdurchführung:
Aufgrund des Versuchsaufbaus ist eine Beobachtung der Tiere nach dem Absetzen des Zearalenons nicht möglich, so daß über das Abklingen zuvor erzielter Effekte keine Aussage gemacht werden kann. Dies ist jedoch für die Zielsetzung dieser Studie nicht von Bedeutung.
Interessanter, insbesondere im Hinblick auf die Beurteilung eventueller auftretenden Fruchtbarkeitsstörungen, ist dagegen die Untersuchung der Auswirkungen von Zearalenon auf den Uterus und die Ovarien.
So beobachteten BAUER et al. (1987 b) nach der Aufnahme von 50 µg Zearalenon/kg Futter zwar keine Anzeichen von Hyperöstrogenismus, aber eine vermehrte Bildung von Tertiärfollikeln. präpubertierende Schweine, die 250 µg Toxin/kg Futter erhielten, wiesen neben deutlichen Veränderungen des Genitaltraktes zahlreiche Tertiärfollikel und zum Teil Follikelzysten auf. LUSKY et al. (1997) konnten nach der Fütterung von 250 µg
Zearalenon/kg Futter keine Symptome von Hyperöstrogenismus feststellen, aber eine große Zahl atretischer Follikel sowie relativ kleine Tertiärfollikel und das Fehlen von Corpora lutea.
Aufgrund dieser Befunde an den Eierstöcken wäre laut LUSKY et al. (1997) das Auftreten von Fruchtbarkeitstörungen vorstellbar.
Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen ist eine Beurteilung von Veränderungen an den Ovarien nicht möglich, da alle getöteten Versuchstiere kastriert sind. Eine Positivkontrolle, d.
h. eine Gruppe unkastrierter Schweine, die Zearalenon erhalten, ist nicht verwendet worden, da die Frage nach der Wirkung bestimmter Zearalenondosierungen nicht zentraler Gegenstand dieser Untersuchungen ist. Hierdurch wird die Einschätzung eventueller Auswirkungen von Zearalenon bzw. Zeolith auf die Fertilität erschwert, aber ein endgültiger Beweis könnte ohnehin nur durch eine ausgedehnte In-Vivo-Studie mit Ermittlung der Umrauschraten, Wurfgrößen etc. erbracht werden.
5.1.2 Probenmaterial
Versuchsabschnitt A:
Um den Einfluß von Zeolith auf das Exkretionsverhalten von Zearalenon zu überprüfen, erfolgt die Bestimmung des über den Harn abgegebene Mykotoxin und seines Metabolits. Das benötigte Probenmaterial kann durch unterschiedliche Verfahren gewonnen werden. Dabei sind Varianten, wie z. B. Katheterisierung und Punktion nicht nur aufwendiger und streßiger für die Versuchstiere als der Aufenthalt in den Bilanzboxen, sondern scheinen auch aufgrund der Versuchsdauer nicht so geeignet. Auch der Einsatz von sogenannten Harntrichtern zum Sammeln von Harn ist insbesondere bei weiblichen Schweinen problematisch. Daher wird der Harn der Schweine in Bilanzboxen aufgefangen wird, die durch die Ausstattung mit Bodenrosten und geneigten Boden ein Ablaufen des Harns in Auffangbehälter zu ermöglichen (s. Abb. 5).
Diese Methode stellt eine einfache und für das Tier wenig belastende Möglichkeit der Harngewinnung dar. Ein Nachteil ist jedoch der erhöhte Verunreinigungsgrad des Probenmaterials. Um eine Kontamination mit Kot zu vermeiden, wird dieser kurz nach dem Absetzten aus den Bilanzboxen entfernt. Das bei Schweinen besonders ausgeprägte
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was auch durch ein Gazestück vor der Öffnung zur Harngewinnung nicht immer vollständig verhindert werden kann. Schwierig ist in diesem Zusammenhang auch das Füttern der Tiere in den Boxen. So erweist sich neben der flüssigen Konsistenz des Futters insbesondere das Freßverhalten der Schweine als problematisch. Eine Verfälschung der Untersuchungsergebnisse durch den Eintrag von zearalenonbelasteten Futter kann jedoch ausgeschlossen werden, da die Aufnahme des Mykotoxin ausschließlich durch die Fütterung des präparierten Zwiebacks direkt aus der Hand erfolgt.
Eine andere Möglichkeit der Untersuchung der Exkretion von Zearalenon nach Aufnahme von Zeolith stellt die Bestimmung der faecalen Ausscheidung dar. Während die Kotgewinnung einfach und wenig belastend für die Versuchstiere ist, bringt die Analyse des Probenmaterials aufgrund der komplexen Matrix erhebliche Probleme mit sich. Neben den auftretenden Schwierigkeiten beim Nachweis von Zearalenon und α-Zearalenol im Kot ist die fehlende Möglichkeit, zwischen zeolithgebundenem und glucuronidierten Zearalenon zu differenzieren, nachteilig, so daß auf Bestimmung der faecalen Exkretion verzichtet wird.
Auch eine Untersuchung der Zearalenon und α-Zearalenolgehalte in Gallensaft und Blut findet nicht statt. Ausschlaggebend für diese Entscheidung sind neben der nicht einfachen Probenmatrix und aufwendigen Gewinnung des Untersuchungsmaterials (Galle), Beobachtungen von LUSKY et al. (1997). Demnach kann Zearalenon nach Aufnahme von 250 µg des Toxins pro kg Futter nicht im Blut nachgewiesen werden, was die Autoren auf einen Verbleib des Mykotoxins im enterohepatischen Kreislauf zurückgeführt.
Versuchsabschnitt B:
Die für die Bestimmung des Uterusgewichtes nötige Entfernung des Organs geschieht nach Betäubung der Schweine und Tötung durch Blutentzug. Um einen unterschiedlichen Ausblutungsgrad und eine möglicherweise damit verbundene Beeinflussung des Gebärmuttergewichtes zu vermeiden, wird der Trockensubstanzgehalt des Uterus ermittelt.
Gleichzeitig kann so eine, durch die östrogenartige Wirkung des Zearalenons bedingte eventuell auftretende, verstärkte Ödematisierung überprüft und damit eine Verfälschung des Organgewichts durch erhöhte Wassereinlagerung ausgeschlossen werden.
5.1.3 Analysenmethoden
Die Bestimmung von Mykotoxinen mittels HPLC ist eine bewährte Analysenmethode. Auch in der vorliegenden Studie ermöglicht die Verbindung mit einem Fluoreszenzdetektor einen quantitativen und qualitativen Nachweis von Zearalenon und α-Zearalenol. Es zeigt sich aber, daß bei der Analyse von Substanzen mit komplexer biologischer Matrix Interferenzen auftreten können. Eine Möglichkeit, dieses Problem auszuschließen, stellt die Verwendung eines Enzymimmunoassays dar. Jedoch ist die Bestimmung der Toxinmenge wegen des Auftretens von Kreuzreaktionen nur durch eine vorherige Auftrennung des Stoffgemisches durchführbar (MEYER et al. (1997). Im Rahmen dieser Untersuchungen wird der schwierigen Probenmatrix Rechnung getragen, indem die Kalibrierung der HPLC-Anlage anhand einer gepoolten zearalenonunbelasteten Harnprobe erfolgt, der eine definierte Menge Toxin zugesetzt wird (siehe Abb. 8a und 8b).
Ein weiteres Analytikproblem stellen sogenannte maskierte Mykotoxine dar. So kann sich z. B. Zearalenon-Glykosid, das durch Konjugation im Stoffwechsel der Wirtspflanze gebildet wird, dem Nachweis im Futtermittel entziehen, jedoch im Organismus nach enzymatischer Spaltung seine Wirkung entfalten (GAREIS et al. 1990). Das vollständige Fehlen von Zearalenon und α-Zearalenol im Harn von Schweinen, die kein Toxin exogen zugeführt bekommen haben, läßt jedoch darauf schließen, daß die im Verlauf dieser Studie verwendeten Futtermittel nicht mit maskierten Zearalenon belastet gewesen sind.
Es liegen bisher aber keine Untersuchungen vor, in welchem Ausmaß Zeolith den Nachweis von Mykotoxinen stört. Bei exemplarischen Vorversuchen im Rahmen dieser Arbeit sind jedoch keine Unterschiede der Zearalenongehalte von Proben, die mit bzw. ohne zugesetzten Zeolith bestimmt werden, feststellbar.
DISKUSSION
5.2 Ergebnisse
5.2.1 Gesundheitsstatus, Futterverwertung und Zuwachsraten
Der Einfluß von Zearalenon und Zeolith auf die Futterverwertung und die täglichen Gewichtszunahmen ist insbesondere im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit von Bedeutung.
Futterverwertung und Zuwachsraten:
Eine Leistungsdepression wachsender Schweine durch eine Mykotoxinbelastung ist von WEIß (1998) und HOPPENBROCK (1999) beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wird durch eine Zearalenonaufnahme von 180 µg Zearalenon/kg Futter über 66 Tage eine signifikante Verschlechterung der Zunahmen induziert, während bei Gehalten von 360 µg ZON/kg Futter keine Verminderung der Zunahmen erfolgt. Die Futterverwertung wird durch eine Zearalenonbelastung nicht beeinflußt (s. Abb. 10).
Neben der Einzeltierhaltung unter experimentellen Bedingungen und der Expositionsdauer könnte die Belastung mit nur einem Mykotoxin von Bedeutung sein. In den obengenannten Untersuchungen wurde Weizen gefüttert, der neben Zearalenon auch mit Deoxynivalenol belastet war. Über sogenannte Potenzierungseffekte ist jedoch nur wenig bekannt und insbesondere beim Schwein liegen nur vereinzelte Untersuchungen vor, die noch dazu zu gegensätzlichen Ergebnissen führten (DROCHNER 1998, DÄNICKE et al. 2000). So stellte LUSKY et al. (1997) bei gleichzeitiger Gabe von Ochratoxin A und Zearalenon an Schweine keine Verstärkung der durch die einzelnen Mykotoxine verursachten Effekte fest.
Die durch den Zusatz von Zeolith beobachteten Effekte stimmen mit Untersuchungsergebnisse von HOPPENBROCK (1999) überein.
0 100 200 300 400 500
Abbildung 10: Durchschnittliche tägliche Zunahmen von Schweinen ohne ( * ) und mit
Zearalenonbelastung (Gruppe 3z und 4 erhalten 180 µg ZON/kg Futter, Gruppe 5z und 6 360 µg ZON/kg Futter). Gruppen mit 2 % Zeolith Zusatz sind mit z gekennzeichnet.
5.2.2 Hyperöstrogenismussymptome
Die Affinität von Zearalenon und α-Zearalenol zum Östrogenrezeptor führt zu Hyperöstrogenismussymptomen, wie Rötung und Schwellung der Vulva, Prolaps des Rektums sowie Schwellung der Milchleiste (GEDEK 1984, COULOMBE 1993, DROCHNER 1998), wobei die Intensität der Symptome und der Zeitpunkt des Auftretens von der aufgenommenen Toxinmenge abhängt.
In den vorliegenden Untersuchungen kann 21 bis 24 Tage nach der Aufnahme von 360 µg