E7/Cre-transgene Maus FVB/N-Wildtyp
5.9 Konstrukte und transgene Mauslinien
Alle transgenen Mauslinien wurden unter Verwendung des FVB/N (Friend leukemia virus, B-type) Mausstamms hergestellt. Dieser Mausstamm zeichnet sich nachweislich durch besondere Sensitivität in Bezug auf Tumorentstehung in der Epidermis aus (Hennings et al., 1993). Ebenso wird er aufgrund seiner prominenter Pronuklei in befruchteten Eizellen vorzugsweise zur Erstellung transgener Linien verwendet (Mahler et al., 1996).
5.9.1 Konstrukt zur Erstellung MnPV-E6-transgener Mäuse
Das Konstrukt K14-ßglo-MnPV-E6-IRES-lacZ-pA wurde von M.Chen erstellt und folgend transgene Mauslinien von H.Pöpperl (DKFZ-Heidelberg) hergestellt (Abb.4.1A). Es wurden acht transgene Linien erzeugt, die sich in ihrer Expressionsintensität unterschieden (Chen, 2000).
Die Expression des transgenen Konstruktes wurde mit Hilfe des lacZ-Reportergens über einen Farbnachweis der ß-Galactosidaseaktivität ermittelt. Die Expression des lacZ-Reportergens war hauptsächlich in Regionen des Gesichtes, der Schnauze, Augen, Ohren, Extremitäten, in der äußeren Schicht der Haarfollikel und des Schwanzes lokalisiert (Abb.4.2). Die Expression des lacZ-Reportergens entspricht dem typischen Expressionsmuster des humanen Cytokeratin-14-Promotors (Byrne et al., 1994).
A
B
Abb. 4.1 A: Konstrukt zur Erstellung MnPV-E6-transgener Mäuse
Die Farbwahl der einzelnen Bereiche wurde entsprechend der Farbwahl der folgenden Sequenz in Abb.
4.1B gewählt. Die zwischen den Genbereichen befindlichen Verbindungslinien bezeichneten die vorhandene Polylinkersequenzen des pKS Plasmides.
K14: Humaner Keratin-14-Promotor/Enhancer; β-globin: Kaninchen β-Globin Intronsequenz mit Exonübergängen; MnPV-E6: codierender Bereich des MnPV-E6-Gens; IRES: interne Ribosomen Eintrittsstelle des Encephalomyokarditis Virus; lacZ: Reportergen codiert β-Galactosidase; pA:
Polyadenylierungssignal des SV40 T-Antigens
B: Nukleotidsequenz des Konstruktes zur Erstellung MnPV-E6-transgener Mäuse Die Farben der Sequenzen entsprechen der Farbwahl der Gene in Abb. 4.1A (Chen, 2000).
K14 ß-globin MnPV E6 IRES lacZ pA
Abb. 4.2 Expressionsmuster in MnPV-E6-transgenen Mausembryos
Die Expressionsintensität des lacZ-Reportergens wurde an Mausembryos aller acht MnPV-E6-transgenen Linien mittels X-gal analysiert. Die Embryonen wurden 14,5 Tage nach Befruchtung isoliert (Chen, 2000).
5.9.2 Konstrukt zur Erstellung induzierbarer MnPV-E7-transgener Mäuse
Zur Erstellung MnPV-E7-transgener Mäuse wurde ein induzierbares System gewählt.
Mit Hilfe des Bakteriophagen-P1-Cre/lox-Systems kann die Produktion des MnPV-E7-Proteins durch einen Rekombinationsvorgang gezielt induziert werden. Das verwendete Konstrukt K14-ßglo-loxP-lacZ-pA-loxP-MnPVE7-pA (Abb. 4.3A) wurde von M.Chen erstellt und folgend die transgene Mauslinie von U.Kloz (Transgener Service, DKFZ-Heidelberg) hergestellt.
A
Abb. 4.3 A: Konstruktes zur Erstellung induzierbarer MnPV-E7-transgener Mäuse
Die Farbgebung der einzelnen Elementen wurde entsprechend der Farbwahl der Sequenzen in Abb. 4.3 B gewählt. K14: Humaner Keratin-14-Promotor/Enhancer; β-globin: Kaninchen β-Globin Intronsequenz mit Exonübergängen; loxP: Rekombinationsstellen der Cre-Rekombinase; lacZ: Reportergen codiert β-Galactosidase; pA: Polyadenylierungssignal des SV40 T-Antigens; E7: Sequenz der MnPV-E7codierenden Bereiche
K14 ß-globin lox P lacZ pA lox P MnPV E7 pA
HP 22-42 HP 21-2 HP 21-13 HP 22-3
HP 22-21 HP 22-12 HP 21-23 HP 21-24
B
Abb. 4.3 B: Nukleotidsequenz des Konstrukes zur Erstellung induzierbarer MnPV-E7 transgener Mäuse
Die Farbwahl der Sequenzen stimmt mit der Farbgebung der Gene in Abb. 4.3A überein (Chen, 2000).
5.9.3 Konstrukt zur Erstellung Cre-Rekombinase-transgener Mäuse
Das verwendete Konstrukt K14-ßglo-cre-pA (Abb. 4.4) wurde von H. Pöpperl (DKFZ-Heidelberg) erstellt und anschließend die transgenen Mäuse von U. Kloz (Transgener Service, DKFZ- Heidelberg) erzeugt (Abb. 4.4). Transgene Mäuse dieser Linie tragen ein Fusionsprotein der bakteriellen Cre-Rekombinase und einer für Tamoxifen anlagerungsfähigen hormonellen Bindungsdomäne eines Estrogen Rezeptors.
Abb. 4.4 Konstruktes zur Erstellung Cre-Rekombinase-transgener Mäuse
K14: Humaner Keratin-14-Promotor/Enhancer; β-globin: Kaninchen β-Globin Intronsequenz mit Exonübergängen; Cre ER T: modifizierte Tamoxifen induzierbare Cre-Rekombinase des P1 Phagen; pA:
Polyadenylierungssignal des SV40 T-Antigens.
K14 ß-globin Cre ER T pA
5.9.4 Enhanced green fluorescence protein (eGFP)-Reporter-Maus zur Detektion der Cre-Rekombinase-Aktivität
Zur funktionellen Untersuchung der Cre-Rekombinase-Aktivität der erstellten K14-ßglo-cre-pA Mauslinie wurde eine Reporter-Maus verwendet. Diese eGFP-Reporterlinie beinhaltet loxP-Stellen die Exon 2 bis 7 des RAGE-Gens (receptor for advanced glycated end products) flankieren (Constien et al., 2001). Mit Hilfe der Cre-Rekombinase werden diese RAGE-Elemente an den loxP-Seiten entfernt, wodurch ein Thymidinkinase-Promotor direkt vor die vorher promotorlose eGFP-Region gesetzt wird. Das eGFP-Gen wird transkribiert und kann mittels Immunfluoreszenz anschließend nachgewiesen werden. Durch Verpaarungen dieser transgenen Linie mit den erzeugten Cre-Rekombinase-transgenen-Mäusen und anschließender Tamoxifen-behandlung derer Nachkommen kann anhand der entstandenen eGFP-Expression die Funktionalität der Cre-Rekombinase-transgenen-Linie ermittelt werden.
6 Methoden
6.1 Zellkulturtechniken
Im Umgang mit Zellkulturen wurden alle Arbeitsschritte unter einer sterilen Werkbank vorgenommen.
6.1.1 Inkulturnahme eukaryontischer Zellen
Die gefrorene Zellsuspension wurde schnell durch Zugabe des jeweiligen Kultivierungsmediums aufgetaut und zur Entfernung des im Einfriermedium vorhandenen DMSO 5 min bei 1000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen in frischem Medium resuspendiert und in der gewünschten Dichte ausplattiert. Es erfolgte eine Inkubation bei 37 °C, 5 % Kohlendioxyd und 95 % Luftfeuchtigkeit. Am darauffolgenden Tag wurde erneut das Medium gewechselt.
6.1.2 Kultivierung eukaryontischer Zellen
Die subkonfluenten Zellen wurden nach Entnahme des Mediums mit PBS gewaschen, mit Trypsin/EDTA-Lösung vom Kultivierungsbehältnis abgelöst und im entsprechenden Medium resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen im gewünschten Verdünnungsverhältnis erneut ausplattiert.
Bei allen Zellen wurde in einem Tonus von 3 Tagen ein Mediumwechsel vorgenommen.
6.1.3 Kryokonservierung eukaryontischer Zellen
Zur Einlagerung von Zellen wurden diese wie in Kap. 2.1.1 trypsiniert, neutralisiert und 5 min bei 1000 Upm sedimentiert. Es wurden jeweils 1x106 Zellen in 1,5 ml DMSO-haltigem Einfriermedium aufgenommen und in Kryokonservierungsröhrchen abgefüllt.
Zunächst erfolgte eine Lagerung bei –70 °C worauf am folgenden Tag die Zellen in einen Flüssigstickstoff-Tank überführt wurden und so langfristig gelagert werden konnten.