3. Material und Methoden
3.8. Progression und Komposition der atherosklerotischen Plaques
3.8.3. Komposition der atherosklerotischen Plaques
Materialien
• Direct Red 80 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)
• 1,2 % Pikrinsäure (AppliChem, Darmstadt, Deutschland)
• Ethanol absolut (AppliChem, Darmstadt, Deutschland)
• Aqua dest.
• Hämatoxylin nach Gill II (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland)
• Xylol (AppliChem, Darmstadt, Deutschland)
• Entellan® (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland)
• Deckgläser Stärke No. 1, 18 x 18 mm (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda Königshofen, Deutschland)
• Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit einer AxioCam MRc (Carl Zeiss, Jena, Deutschland)
Durchführung
Der Kollagenanteil der Gefäßwand wurde mit Hilfe der Siriusrot-Färbung quantifiziert.
Eine Woche vor der Färbung wurde die Siriusrot-Lösung durch Lösen von 0,1 g Direct Red 80 in 100 ml 1,2 prozentiger Pikrinsäure hergestellt. Nachdem die Gewebeschnitte aufgetaut und getrocknet waren, wurden sie jeweils zehn Minuten in eine absteigende Ethanolreihe (100 %, 90 %, 70 %) gegeben und anschließend mit Aqua dest. gewa-schen. Die Darstellung der Zellkerne erfolgte durch zweiminütige Färbung mit Häma-toxylin. Nachdem die Gewebeschnitte unter fließendem Aqua dest. gespült wurden, folg-te eine fünfzehnminütige Färbung mit Siriusrot. Im Anschluss wurden die Gewebeschnit-te jeweils zehn MinuGewebeschnit-ten in eine aufsGewebeschnit-teigende Ethanolreihe (70 %, 90 %, 100 %) gegeben und schließlich weitere zehn Minuten in Xylol belassen. Abschließend wurde ein Deck-gläschen mit Entellan® benetzt und auf den Objektträger aufgebracht.
Die Aufnahmen der Gewebeschnitte erfolgten an einem Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit einer AxioCam MRc unter Verwendung eines Polarisationsfilters. Die Quantifizierung des Kollagenanteils erfolgte verblindet mit Hilfe der AxioVision Software Rel. 4.8. Es wurde der prozentuale Anteil der kollagen-positiven Fläche am Gesamtquerschnitt der Gefäßwand berechnet.
3.8.3.2. ASMAC-Färbung Material
• Aceton (AppliChem, Darmstadt, Deutschland)
• Fettstift: Dako Pen S2002 (Dako Denmark A/S, Glostrup, Dänemark)
• PBS (pH 7,4; in g/l: KCl 2, KH2PO4 2,4, NaCl 80, Na2HPO4 14,4)
• Bovines Serum Albumin Fraktion V pH 7,0 (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich)
• Monoklonaler muriner anti-Actin, alpha-Smooth Muscle-Cy3 Antikörper (C6198-2ML) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)
• Vectashield mounting medium mit DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)
• Deckgläser Stärke No. 1, 18 x 18 mm (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda Königshofen, Deutschland)
• Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit einer AxioCam MRc (Carl Zeiss, Jena, Deutschland)
Durchführung
Der Gehalt an vaskulären glatten Muskelzellen auf Höhe der Aortenwurzel wurde durch eine Färbung gegen glattmuskuläres alpha-Aktin ermittelt.
Die Gewebeschnitte wurden dreißig Minuten bei -20 °C in Aceton fixiert und anschlie-ßend mit einem Fettstift umrandet. Nach fünfminütigem Waschen mit PBS wurde mit 0,5 % bovinen Serum Albumin (BSA) in PBS geblockt und für dreißig Minuten bei Raum-temperatur inkubiert. Als Nächstes wurde der verdünnte Antikörper (1:400 in PBS mit 0,5 % BSA) auf die Objektträger gegeben und dort für eine Stunde bei Raumtemperatur unter Ausschluss von Licht belassen. Anschließend wurden die Objektträger dreimal mit PBS gewaschen und ein Deckglas mit Vectashield mounting medium mit DAPI aufge-bracht.
Die Fluoreszenzaufnahmen wurden an einem Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit einer AxioCam MRc und der AxioVision Software Rel. 4.8 erstellt und verblindet ausgewertet.
3.8.3.3. CD3-Färbung Materialien
• Aceton (AppliChem, Darmstadt, Deutschland)
• PBS (pH 7,4; in g/l: KCl 2, KH2PO4 2,4, NaCl 80, Na2HPO4 14,4)
• BSA Fraktion V pH 7,0 (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich)
• Fettstift: Dako Pen S2002 (Dako Denmark A/S, Glostrup, Dänemark)
• primärer Antikörper: Rabbit polyclonal to CD3 antibody (ab5690) (Abcam, Cam-bridge, Großbritannien)
• sekundärer Antikörper: Cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (Dianova, Hamburg, Deutschland)
• Vectashield mounting medium mit DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)
• Deckgläser Stärke No. 1, 18 x 18 mm (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda Königshofen, Deutschland)
• Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit einer AxioCam MRc (Carl Zeiss, Jena, Deutschland)
Durchführung
Die T-Zell-Infiltration in den Gewebeschnitten auf Klappenebene wurde durch eine im-munhistochemische Färbung gegen den Marker CD3 ermittelt.
Die getrockneten Objektträger wurden zwanzig Minuten bei -20 °C in Aceton fixiert und anschließend dreimal mit PBS gewaschen. Dann folgte ein BSA-Block, um unspezifi-sche Antikörperbindungen zu reduzieren und damit Hintergrundsignale zu minimieren.
Nachdem eine halbe Stunde mit 1 % BSA in PBS geblockt wurde, konnte der 1:50 in der Block-Lösung verdünnte primäre Antikörper aufgebracht werden. Die Inkubation erfolgte bei 4 °C über Nacht. Am folgenden Tag wurde dreimal mit PBS gewaschen und mit dem 1:500 in 1 % BSA in PBS verdünnten sekundären Antikörper eine Stunde unter Aus-schluss vom Licht inkubiert. Nach dreimaligem Waschen konnten die Gewebeschnitte auf den Objektträgern mit Vectashield mounting medium eingedeckt werden. Die Dar-stellung der Zellkerne erfolgte durch, im Eindeckmedium enthaltenes, 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI).
Die Fluoreszenzaufnahmen wurden an einem Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit einer AxioCam MRc und der AxioVision Software Rel. 4.8 erstellt und verblindet ausgewertet.
3.8.3.4. CD68-Färbung Materialien
• Aceton (AppliChem, Darmstadt, Deutschland)
• PBS (pH 7,4; in g/l: KCl 2, KH2PO4 2,4, NaCl 80, Na2HPO4 14,4)
• BSA Fraktion V pH 7,0 (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich)
• Fettstift: Dako Pen S2002 (Dako Denmark A/S, Glostrup, Dänemark)
• primärer Antikörper: α-CD68 rat IgG2a (SM15500) (Acris antibodies GmbH, Her-ford, Deutschland)
• sekundärer Antikörper: Cy3 AffiniPure Donkey anti-Rat IgG (Jackson Immu-noResearch Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA)
• Vectashield mounting medium mit DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)
• Deckgläser Stärke No. 1, 18 x 18 mm (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda Königshofen, Deutschland)
• Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit einer AxioCam MRc (Carl Zeiss, Jena, Deutschland)
Durchführung
Die Akkumulation von Makrophagen wurde durch Immunfluoreszenz nachgewiesen.
Die Gewebeschnitte wurden bei Raumtemperatur getrocknet und zunächst zwanzig Mi-nuten bei -20 °C in Aceton fixiert. Anschließend wurden die Schnitte dreimal mit PBS gewaschen und mit Hilfe eines Fettstifts umrandet. Es folgte ein halbstündiges Blocken mit 2 % BSA in PBS. Als primärer Antikörper diente α-CD68 rat IgG2a 1:100 in 1 % BSA in PBS verdünnt. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgte bei 4 °C über Nacht. Am nächsten Tag konnte nach dreimaligem Waschen mit PBS der sekundäre Antikörper Cy3 AffiniPure Donkey anti-Rat IgG 1:500 in der Block-Lösung verdünnt auf-gebracht werden. Anschließend folgten eine einstündige Inkubation bei Dunkelheit und
ein erneutes dreimaliges Waschen mit PBS. Zum Schluss konnte ein Deckglas mit Vectashield mounting medium mit DAPI aufgebracht werden.
Die Fluoreszenzaufnahmen wurden an einem Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit einer AxioCam MRc und der AxioVision Software Rel. 4.8 erstellt und verblindet ausgewertet.
3.8.3.5. Ly6G-Färbung Material
• Aceton (AppliChem, Darmstadt, Deutschland)
• PBS (pH 7,4; in g/l: KCl 2, KH2PO4 2,4, NaCl 80, Na2HPO4 14,4)
• Fettstift: Dako Pen S2002 (Dako Denmark A/S, Glostrup, Dänemark)
• Normal goat serum (Dianova, Hamburg, Deutschland)
• primärer Antikörper: Rat Anti-Mouse Ly6G (551459) (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA)
• sekundärer Antikörper: Cy3 AffiniPure Donkey anti-Rat IgG (Jackson Immu-noResearch Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA)
• Vectashield mounting medium mit DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA USA)
• Deckgläser Stärke No. 1, 18 x 18 mm (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda Königshofen, Deutschland)
• Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit einer AxioCam MRc (Carl Zeiss, Jena, Deutschland)
Durchführung
Die Infiltration neutrophiler Granulozyten wurde durch die Ly6G-Färbung dargestellt.
Die Gewebeschnitte wurden hierzu zunächst dreißig Minuten in Aceton fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde jeder Gewebeschnitt mit Hilfe eines Fettstifts um-randet. Anschließend wurde mit 10 % Normal Goat Serum in PBS 65 Minuten bei Raumtemperatur geblockt. Der primäre Antikörper Ly6G wurde, 1:200 in 1 % Normal Goat Serum in PBS verdünnt, auf die Gewebeschnitte gegeben und dort über Nacht belassen. Am nächsten Tag konnte nach dreimaligem Waschen mit PBS der 1:500 mit PBS verdünnte sekundäre Antikörper Cy3 AffiniPure Donkey anti-Rat IgG auf die
Ge-webeschnitte gegeben werden. Es folgte eine Inkubationszeit von achtzig Minuten bei Raumtemperatur unter Ausschluss von Licht. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit PBS wurden eine dünne Spur Vectashield mounting medium mit DAPI auf einem Deck-glas verteilt und auf den Objektträger aufgebracht.
Die Fluoreszenzaufnahme und die Auswertung der gefärbten Gewebeschnitte wurde mit einem Zeiss Axiovert 200M Mikroskop, einer AxioCam MRc und der Zeiss AxioVision Software 4.8 durchgeführt. Die Auswertung erfolgte verblindet.