2.3 Molekulare Angriffsziele der Aminopyrimidin-GSMs
2.3.5 Kompetitionsstudien mit GSMs und GSIs deuten auf gemeinsame
Ergebnisse
0 20 40 60 80 100
Bindung (% der Kontrolle) PS1NTF
0 20 40 60 80
100 PS2NTF
1%Input +- ++ ++ ++ ++ ++ ++ RO-57-BpB UV!
34
34
PS1NTF kDa
PS2NTF
Bindung (% der Kontrolle)
1%Input +- ++ ++ ++ ++ ++ ++ RO-57-BpB UV!
34 PS1NTF
kDa
1 2 3 4 5 6 7 8
Abbildung 51:Nicht-acidische GSMs der zweiten Generation von Eisai und TorreyPi-nes Therapeutics kompetieren differenziell mit RO-57-BpB um die Bindung an das PS1- und PS2-NTF.Membranfraktionen von HEK293-Zellen wurden mit 1 µM RO-57-BpB sowie DMSO als Kontrolle und 100µM RO-57, ES 1, ES 2, TP 1 und TP 2 als Kompetitoren im Photoaffinit¨atsmarkierungsassay eingesetzt, die mit Streptavidin gef¨allten Proteine mittels SDS-PAGE (10-20%iges Tris-Tricin-Gel) aufgetrennt und PS1- und PS2-NTF mittels IB detektiert.
Links ist ein repr¨asentativer IB gezeigt, rechts die Quantifizierung des Signals f¨ur PS1- bzw. PS2-NTF. Das Balkendiagramm zeigt die auf die Kontrolle normierten Mittelwerte±Standardfehler (n = 3).
2.3.5 Kompetitionsstudien mit GSMs und GSIs deuten auf gemeinsame
Ergebnisse
0 20 40 60 80 100
0 20 40 60 80
100 PS1NTF PS2NTF
1%Input +- ++ ++ ++ ++ ++ ++ RO-57-BpB UV!
34
34
PS1NTF kDa
PS2NTF
Bindung (% der Kontrolle) Bindung (% der Kontrolle)
1 2 3 4 5 6 7 8
Abbildung 52: NSAID-¨ahnliche GSMs kompetieren differentiell mit RO-57-BpB um die Bindung an das PS1- und PS2-NTF.Membranfraktionen von HEK293-Zellen wurden mit 1 µM RO-57-BpB sowie DMSO als Kontrolle und 100µM RO-57, Sulindac Sulfid, GSM-1, Fenofibrat und TO-901317 als Kompetitoren im Photoaffinit¨atsmarkierungsassay eingesetzt, die mit Streptavidin isolierten Proteine mittels SDS-PAGE (10-20%iges Tris-Tricin-Gel) aufgetrennt und PS1- und PS2-NTF mittels IB detektiert. Links ist ein repr¨asentativer IB gezeigt, rechts die Quantifizierung des Signals f¨ur PS1- bzw. PS2-NTF. Das Balkendiagramm zeigt die auf die Kontrolle normierten Mittelwerte±Standardfehler (n = 3 - 6).
lich mit RO-57-BpB um die Bindung des PS1- und des PS2-NTFs (Abb. 51, Spur 5 und 6 im IB). F¨ur ES 1 war die Kompetition sogar deutlich st¨arker als f¨ur RO-57. Dieses Ergebnis ist ein deutlicher Hinweis darauf, dass ES 1 und ES 2 die Bindungsstelle im PS1- bzw. PS2-NTF mit den Aminopyrimidinen teilen. Im Gegensatz dazu zeigten zwei Derivate der Serie A aus Kounnaset al.[407], TP 1 und TP 2, ein differenzierteres Bild:
W¨ahrend TP 1 nur geringf¨ugig schlechter als RO-57 und somit partiell mit RO-57-BpB um die Bindung an das PS1- und PS2-NTF kompetierte, zeigte TP 2 kaum Kompetition (Abb. 51, Spur 7 und 8 im IB). Dies k¨onnte darauf beruhen, dass TP 2 und RO-57-BpB keine ¨uberlappende Bindungsstelle haben. Aber in Anbetracht des partiellen Kompe-titionsverhaltens des weniger lipophilen TP 1, dessen Strukturformel sich nur um ein Stickstoffatom von TP 2 unterscheidet (Pyridin statt Benzol), k¨onnte die Reduktion der Kompetition von TP 2 im Vergleich zu der von TP 1 auch an erh¨ohter Lipophilie oder schlechter L¨oslichkeit von TP 2 liegen (siehe 3.7).
Als n¨achstes wurde das Kompetitionsverhalten von NSAID-¨ahnlichen GSMs unter-sucht. Dabei wurden f¨ur Aβ42-erniedrigende und inverse GSMs jeweils ein Vertreter der ersten und der zweiten Generation ausgew¨ahlt. Sulindac Sulfid ist als einer der bekann-testen GSMs der ersten Generation ca. 400-fach weniger potent als GSM-1 (siehe 4.1.3).
Dennoch kompetierte Sulindac Sulfid erheblich st¨arker als GSM-1 mit RO-57-BpB um die Bindung an PS1- und PS2-NTF. F¨ur das PS1-NTF war die Kompetition sogar st¨arker als f¨ur die Ausgangssubstanz RO-57 (Abb. 52, Spur 5 im IB). GSM-1 hingegen konnte nur f¨ur das PS2-NTF in der gleichen St¨arke wie RO-57 kompetieren, f¨ur das PS1-NTF
Ergebnisse
0 20 40 60 80 100 120
Binding (% der Kontrolle) PS1NTF
0 20 40 60 80 100 120
Binding (% der Kontrolle) PS2NTF
34
34
PS1NTF
PS2NTF 1% + + + + + RO-57-BpB Input - + + + + UV!
kDa
Abbildung 53: Sulindac Sulfon kompetiert nicht mit RO-57-BpB um die Bindung an das PS1- und PS2-NTF.Membranfraktionen von HEK293-Zellen wurden mit 1µM RO-57-BpB sowie DMSO als Kontrolle und 100 µM RO-57, Sulindac Sulfid sowie Sulindac Sulfon als Kompetitoren im Photoaffinit¨atsmarkierungsassay eingesetzt, die mit Streptavidin isolierten Proteine mittels SDS-PAGE (10-20%iges Tris-Tricin-Gel) aufgetrennt und PS1- und PS2-NTF mittels IB detektiert. Links ist ein repr¨asentativer IB gezeigt, rechts die Quantifizierung des Signals f¨ur PS1- bzw. PS2-NTF. Das Balkendiagramm zeigt die auf die Kontrolle normierten Mittelwerte±Standardfehler (n = 5).
war die Kompetition deutlich schw¨acher (Abb. 52, Spur 6 im IB). Im Gegensatz dazu war das Bild f¨ur die beiden getesteten inversen GSMs einheitlicher: Sowohl Fenofibrat als auch TO-901317 kompetierten kaum mit RO-57-BpB, etwa in gleichem Ausmaß f¨ur PS1- und PS2-NTF (Abb. 52, Spur 7 und 8 im IB).
Angesichts des ¨uberraschend starken Kompetitionsverhaltens von Sulindac Sulfid lag es nahe, das Kompetitionsverhalten von Sulindac Sulfon zu pr¨ufen. Das Sulfon ist sowohl bez¨uglich der COX-Inhibition [452] als auch derγ-Sekretasemodulation inaktiv [396,409].
Wenn dieses inaktive Derivat nun ein ¨ahnlich starkes Kompetitionsverhalten wie das Sulfid zeigte, w¨are dies ein starker Hinweis darauf, dass die Kompetition des Sulfids auf unspezifische Effekte zur¨uckzuf¨uhren ist. Im Gegensatz zu Sulindac Sulfid konnte das Sulfon aber nicht mit RO-57-BpB um die Bindung an PS1- und PS2-NTF kompetieren (siehe Abb. 53). Somit kann mit diesem Ergebnis nicht auf einen unspezifischen Effekt im Falle der Kompetition von Sulindac Sulifd geschlossen werden.
Abschließend sollte f¨ur NSAID-¨ahnliche Aβ42-senkende GSMs der ersten Generation gepr¨uft werden, ob diese generell stark mit RO-57-BpB kompetitieren und damit eine gemeinsame Bindungsstelle mit den Aminopyrimidin-GSMs im PS-NTF wahrscheinlich ist. Wenn das starke Kompetitionsverhalten in der Grundstruktur der NSAID-¨ahnlichen GSMs begr¨undet w¨are, sollte Indomethacin, das eine ¨ahnliche Struktur wie Sulindac Sul-fid besitzt, ebenfalls mit RO-57-BpB um die Bindung an PS1- und PS2-NTF kompetieren k¨onnen. Interessanterweise konnte Indomethacin nur ¨außerst schwach mit RO-57-BpB
66
Ergebnisse
0 20 40 60 80 100
veh.
0 20 40 60 80 100
veh.
B
Indomethacin (Indo)
inaktives
Indomethacinderivat 1 (IID 1)
inaktives
Indomethacinderivat 2 (IID 2)
A
PS1NTF PS2NTF
34
34
PS1NTF
PS2NTF
Bindung (% der Kontrolle) Bindung (% der Kontrolle) 1% + + + + + + RO-57-BpB
Input - + + + + + UV!
kDa
Abbildung 54: Indomethacin kompetiert nicht mit RO-57-BpB um die Bindung an das PS1- und PS2-NTF. Membranfraktionen von HEK293-Zellen wurden mit 1 µM RO-57-BpB sowie DMSO als Kontrolle und 100 µM RO-57, Indomethacin sowie zwei inaktiven Indomethacinderivaten als Kompetitoren im Photoaffinit¨atsmarkierungsassay eingesetzt, die mit Streptavidin isolierten Proteine mittels SDS-PAGE (10-20%iges Tris-Tricin-Gel) aufgetrennt und PS1- und PS2-NTF mittels IB detektiert. Links ist ein repr¨asentativer IB gezeigt, rechts die Quantifizierung des Signals f¨ur PS1- bzw. PS2-NTF. Das Balkendiagramm zeigt die auf die Kontrolle normierten Mittelwerte±Standardfehler (n = 3).Indo, Indomethacin;IDD 1, inaktives Indomethacinderivat 1;IDD 2, inaktives Indomethacinderivat 2.
kompetieren (siehe Abb. 54). Sehr ¨uberraschend war jedoch, dass beide inaktive Derivate das PS1- und PS2-NTF-Signal auf etwa 50% reduzierten. Somit zeigten diese Substanzen unabh¨angig von ihrer (nicht vorhandenen) modulatorischen Aktivit¨at eine Kompetition, was darauf hindeutet, dass das Verhalten dieser Substanzklasse mit unspezifischen Ne-beneffekten verbunden sein kann und deshalb die Kompetition von Sulindac Sulfid mit Vorsicht zu interpretieren ist (siehe 3.7).
Als letzte Substanzgruppe wurden GSIs im Kompetitionsassay getestet. Dazu wur-den Derivate verschiewur-dener Klassen ausgew¨ahlt: L-685,458 [218, 221] als ¨ Ubergangszu-standsanalogon, DAPT [364, 365] und LY-411,575 [367, 368] f¨ur allosterische, dipeptidi-sche GSIs sowie das Sulfonamid Begacestat [386, 387], das die Prozessierung von APP st¨arker als die von Notch1 inhibiert (siehe 1.6.1). Da die IC50-Werte f¨ur alle verwendeten GSIs im niedrig-nanomolaren Bereich liegen (siehe 4.1.3), wurden sie mit 1 µM f¨ur die Kompetitionsstudien eingesetzt. L-685,458 zeigte als einziger getesteter GSI eine leichte
Ergebnisse
0 50 100 150 200
0 20 40 60 80 100
120 PS2NTF
1%Input +- ++ ++ ++ ++ ++ ++ RO-57-BpB UV!
34
34
PS1NTF
kDa
PS2NTF
Bindung (% der Kontrolle) PS1NTF
Bindung (% der Kontrolle)
1 2 3 4 5 6 7 8
Abbildung 55:GSIs kompetieren mehrheitlich nicht mit RO-57-BpB um die Bindung an das PS1- und PS2-NTF.Membranfraktionen von HEK293-Zellen wurden mit 1µM RO-57-BpB sowie DMSO als Kontrolle und 100µM RO-57 bzw. 1µM L-685,458, DAPT, LY-411,575 und Begacestat als Kompetitoren im Photoaffinit¨atsmarkierungsassay eingesetzt, die mit Streptavidin isolierten Proteine mittels SDS-PAGE (10-20%iges Tris-Tricin-Gel) aufgetrennt und PS1- und PS2-NTF mittels IB detektiert. Links ist ein repr¨asentativer IB gezeigt, rechts die Quantifizierung des Signals f¨ur PS1- bzw. PS2-NTF. Das Balkendiagramm zeigt die auf die Kontrolle normierten Mittelwerte±Standardfehler (n = 3).
Kompetition gegen die Bindung von RO-57-BpB an das PS1- und PS2-NTF (Abb. 55, Spur 5); LY-411-575 hingegen kompetierte geringf¨ugig und nur f¨ur die Bindung von RO-57-BpB an das PS2-NTF, w¨ahrend die Bindung an das PS1-NTF um etwa 70% erh¨oht war (Abb. 55, Spur 7). Kompetition mit DAPT und Begacestat hatte kaum Einfluss auf die RO-57-BpB-Bindung (Abb. 55, Spur 6 und 8). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass wahrscheinlich nur die Bindungsstellen von RO-57-BpB und L-685,458 ¨uberlappen, und dies nur in geringem Ausmaß.
2.3.6 Das Kompetitionsverhalten von RO-53 deutet auf eine distinkte