Kombinationsversuch (TXST 20000131)

Bei dem Range-finding Test und der definitiven Prüfung des Methyltestosterons kam es zu einem Vitellogeninanstieg und damit zu einer partiellen Verweiblichung der Jungfische, welche allerdings makroskopisch nicht sichtbar war. Für dieses unerwartete Ergebnis gab es zwei unterschiedlichen Hypothesen, welche durch einen zusätzlichen Versuch belegt werden sollten. Zum einen wäre es möglich, dass das Methyltestosteron in so großen Mengen von den Tieren aufgenommen wurde, dass es trotz der geringen Affinitiät, aber auf Grund der hohen Kapazität an den Estrogen Rezeptor bindet. Zum anderen kann das Methyltestosteron durch die endogene Aromatase zu einem Estrogen aromatisiert werden, welches dann die Verweiblichung hervorruft.

Da der CERBA im Rahmen dieser Arbeit nicht erfolgreich etabliert und damit die mögliche Bindung von Methyltestosteron an den ER nicht nachgewiesen werden konnte, sollte auf eine andere Weise eine der Hypothesen verifiziert werden.

Es wurde bei einer verkürzten Verträglichkeitsprüfung eine Kombination aus Methyltestosteron und Fadrozol eingesetzt. Wobei das Fadrozol hier eine mögliche Aromatisierung des Methyltestosterons durch die Aromatase verhindern sollte.

Der Versuch wurde auf 14 Tage verkürzt, da der Vitellogeninanstieg bei den Methyltestosteron exponierten Fischen schon ab Tag 7 deutlich zu erkennen war. Um Fische einzusparen wurden statt 32 Fische nur 10 pro Tötungszeitpunkt und Gruppe für den VTG-ELISA eingesetzt, plus 5 Zusatzfische, die im Anschluss an die Exposition in frisches Leitungswasser umgesetzt und bis zur Ausbildung sekundärer Geschlechtsmerkmale gehältert wurden. Auf eine Leitungswasserkontrolle wurde verzichtet, da eine Lösungsvermittlerkontrolle mitlief und in den vorangegangenen Versuchen kein Unterschied in den Vitellogeninwerten der beiden Kontrollen nachgewiesen werden konnte. Die Zahl der Fische zur mRNA Bestimmung wurde nicht geändert.

Es wurden Konzentrationen der Testsubstanzen gewählt, welche schon in den definitiven Prüfungen getestet wurden. Allerdings wurde in diesem Fall auch Fadrozol in einem Gemisch aus DMF und Wasser (1:4) als Stammlösung gelöst, um in allen Gruppen gleiche Bedingungen zu gewährleisten. Insgesamt bestand der Versuch aus 4 Gruppen, einer Lösungsvermittlerkontrolle (31mg DMF/l), 10µg MT/l, 50µg F/l und einer vierten Gruppe mit 10µg MT + 50µg F/l.

3.6.8.1 Begutachtung der Fische über den Versuchzeitraum

Die exponierten Fische wiesen über den gesamten Versuchzeitraum von 14 Tagen keine krankhaften makroskopischen Veränderungen auf. Es kam auch zu keinem einzigen Todesfall. Am Tag 13 der Exposition kam es zu einer sehr plötzlich eintretenden Verhaltensänderung. Die noch nicht getöteten Fische in Gruppe 4 (Kombination mit beiden Substanzen) zeigten ein sehr agressives Verhalten, es kam zu Revierkämpfen. Zudem war bei allen Fischen eine leichte Schwarzfärbung der Rückenflosse zu erkennen. Innerhalb eines Tages verstärkte sich die Agressivität noch, die Rückenflosse war bei allen Fischen aus dieser Gruppe komplett schwarz und die Kiemendeckel begannen sich ebenfalls schon schwarz zu färben. In Gruppe 2 (10µg MT/l) wurde ebenfalls bei einigen Fischen eine leichte Pigmentierung der Rückenflosse beobachtet, allerdings zeigten nur 2 größere Fische ein agressives Verhalten.

An Tag 14 wurden 12 Fische aus jeder Gruppe getötet und auf weitere sekundäre Geschlechtsmerkmale untersucht. Alle Fische aus Gruppe 4 zeigten die ersten Ansätze einer Tuberkelbildung auf der Nasenspitze (siehe Abb. 3.12). Diese Tuberkelbildung und ebenso die Schwarzfärbung der Kiemendeckel wird bei nicht exponierten Fischen erst ab ca. 7 Monaten, bei Eintritt in die Geschlechtsreife, sichtbar. Die eingesetzten Fische waren zu Beginn der Exposition <3 Monate alt.

Durch diese Verhaltens- und makroskopischen Veränderungen wurde deutlich, dass Methyltestosteron im Fisch aromatisiert werden kann. Wird diese Aromatisierung durch Zugabe eines Aromatasehemmers, wie z.B. Fadrozol verhindert kommt es zu einer sehr schnellen Vermännlichung der Fische.

Abbildung 3.1.Kombinationsversuch mit Methyltestosteron und Fadrozol, Tuberkelbildung an der Nasenspitze von exponierten Jungfischen

Tabelle 3.1. Mittleres Körpergewicht und Länge der exponierten Fische (Kombinationsversuch), n = 10.

Gruppe Tag 0

[mg/mm]

Tag 4 [mg/mm]

Tag 7 [mg/mm]

Tag 14 [mg/mm]

1 unbehandelte 45.1 / 12 175.5 / 19 162.6 / 19

2 Fische 176.9 / 17 154.1 / 18 127.2 / 16

3 84.8 / 14 57.9 / 14 80.9 / 15 139.1 / 17

4 35.7 / 12 77.8 / 14 201.8 / 21

3.6.8.2 Vitellogeninkonzentrationen im Ganzkörperhomogenat

Die aus den Becken entnommenen Fische wurden homogenisiert und der Vitellogeninlevel im Ganzkörperhomogenat bestimmt, um einen Vergleich mit den durchgeführten definitiven Tests zu erhalten.

Abbildung 3.1. Kombinationsversuch mit Methyltestosteron und Fadrozol, Vitellogenin-konzentrationen im Ganzkörperhomogenat, n = 10.

Die Vitellogeninkonzentrationen des Ganzkörperhomogenats sind, wie in Abbildung 3.14 zu sehen ist, durch die Exposition mit Methyltestosteron signifikant angestiegen. In der Gruppe 3, bei einer Exposition mit Fadrozol alleine konnte kein Anstieg beobachtet werden und in Gruppe 4, bei der Exposition mit beiden Substanzen im Gemisch stieg der Vitellogeninlevel ebenfalls nicht an.

Dieses Ergebnis zeigt ebenso deutlich wie die Verhaltensänderungen, dass Fadrozol bei den Fischen als Aromataseinhibitor wirksam war. Zudem kann auf Grund dieser Ergebnisse die teilweise Verweiblichung der Methyltestosteron exponierten Fische erklärt werden. Das 17α-Methyltestosteron wird vermutlich durch die Aromatase zu 17α-Methylestradiol verstoffwechselt (D. Kime, pers. kom.). Durch die Methylierung am C17 wäre das Estrogen metabolisch stabiler als das endogene Estradiol. Die längere Verweildauer könnte so auch den sehr starken Vitellogeninanstieg erklären.

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

Lösungsverm. 10µg MT/l 50µg F/l 10µg MT + 50µg F/l

Vitellogenin [ng/ml Homogenat]

Tag 4 Tag 7 Tag 14

*

*

*

*

3.6.8.3 RT-PCR

Die RT-PCR diente einer weiteren Überprüfung der Ergebnisse und als zusätzliche Vergleichsmöglichkeit mit den durchgeführten definitiven Tests.

Abbildung 3.1. Kombinationsversuch mit Methyltestosteron und Fadrozol, RT-PCR zum Nachweis von Vitellogenin, Actin und Estrogen Rezeptor mRNA, n = 2.

Durch die RT-PCR konnte sehr deutlich gezeigt werden, dass es nur bei den Methyltestosteron exponierten Fischen zu einer Vitellogenin mRNA Expression kam. Weder bei der Lösungsvermittlerkontrolle, den Fadrozol exponierten Fischen, noch bei der Kombination der beiden Substanzen konnte Vitellogenin mRNA nachgewiesen werden.

Auch dieses Ergebnis stützt die Hypothese der Aromatisierung des Methyltestosterons zu einem Estrogen.

3.7 Early-Life Stage Test