3 Ergebnisse
3.2 Behandlung mit Anti-‐HER-‐2-‐Substanzen
3.2.3 Kombination Trastuzumab und Pertuzumab
B
Abbildung 15: Western Blot (A) und Zellviabilitätsmessung (B) nach der Behandlung mit Afatinib
3.2.3 Kombination Trastuzumab und Pertuzumab
Wie zuvor aufgeführt, zeigten sich in der Monotherapie mit Trastuzumab und Pertuzum-‐
ab keine phänotypisch relevanten Effekte auf die Zellviabilität und auch nur ein modera-‐
ter Effekt auf die pAkt-‐Level (s. Abb. 11 und 12). Da beim Mammakarzinom bereits eine duale Antikörpertherapie gegen den HER-‐2-‐Rezeptor mittels Trastuzumab und Pertuzum-‐
ab zur Anwendung kommt (Swain et al. 2015a), wurde die Kombinationstherapie auch in der vorliegenden Arbeit überprüft. Im Folgenden wurden daher aus den Ergebnissen der Western Blots (s. Abb. 11A und 12A) für jeden der beiden Antikörper eine niedrige und eine hohe Konzentration gewählt, welche dann mit ansteigenden Konzentrationen des anderen Antikörpers kombiniert wurden. Als niedrige Konzentration wurde für beide An-‐
tikörper 1 µg/ml gewählt. Die hohe Konzentration orientierte sich daran, dass im Western Blot ein deutlicher Einfluss auf das pAkt-‐Level zu sehen war. Folgende Dosierungen wur-‐
den ausgewählt:
• LS513: 1 bzw. 20µg/ml Trastuzumab, 1 bzw. 20µg/ml Pertuzumab
• LS1034: 1 bzw. 100µg/ml Trastuzumab, 1 bzw. 50µg/ml Pertuzumab
• SW837: 1 bzw. 20µg/ml Trastuzumab, 1 bzw. 100µg/ml Pertuzumab.
Beide Konzentrationen des einen Antikörpers wurden nun sowohl für den Western Blot als auch im Zellviabilitätsassay mit der Verdünnungsreihe des anderen Antikörpers kom-‐
biniert.
3.2.3.1 Trastuzumab kombiniert mit Pertuzumab
Im Western Blot zeigte die Kombination einer festen Konzentration von 1 µg/ml Trastu-‐
zumab mit einer Pertuzumab-‐Verdünnungsreihe in allen drei Zelllinien einen dosisabhän-‐
gigen deutlichen Einfluss auf pAkt (s. Abb. 16A). Im Zellviabilitätsassay waren die Ergeb-‐
nisse in allen drei Zelllinien dosisabhängig zwar statistisch signifikant (LS513: p = 1.8e-‐25, LS1034: p = 6.3e-‐24, SW837: p = 6.8e-‐20), jedoch gab es keine phänotypisch relevante Reduktion der Zellviabilität (s. Abb. 16B). Auch über die verschiedenen Messzeitpunkte konnten für die Zelllinien LS513 und SW837 zwar signifikante Unterschiede errechnet werden (LS513: p = 1.2e-‐12, SW837: p =1.4e-‐08), jedoch erschien die Zellviabilität nicht deutlich verändert. Für LS1034 ergab sich kein signifikanter Unterschied über die Zeit (p = 0.02) (s. Abb. 16B).
LS513 LS1034 SW837
A
B
Abbildung 16: Western Blots (A) und Zellviabilitätsmessungen (B) nach Behandlung mit 1 µg/ml Trastuzumab und Pertuzumab
Wie erwartet, zeigte sich auch für die höhere Dosierung von Trastuzumab (20 µg/ml bei LS513 und SW837 bzw. 100 µg/ml bei LS1034) in Verbindung mit einer Pertuzumab-‐
Verdünnungsreihe im Western Blot eine deutliche Reduzierung der pAkt-‐Level in den drei
Zelllinien (s. Abb. 17A). Es zeigte sich kein relevanter Unterschied zwischen der Behand-‐
lung mit der niedrigen (1 µg/ml) und der hohen Konzentration (20 bzw. 100 µg/ml) Trastu-‐
zumab mit der Pertuzumab-‐Verdünnungsreihe. Folglich ist auch durch Erhöhung der Kon-‐
zentration kein stärkerer Effekt auf den untergeordneten Signalweg zu erzielen. Im Zellvi-‐
abilitätsversuch führte die Kombination von 20 µg/ml Trastuzumab mit aufsteigenden Konzentrationen Pertuzumab für die Zelllinien LS513 und SW837 zu signifikanten, jedoch phänotypisch lediglich kleinen Unterschieden über die Dosis (LS513: p = 1.1e-‐19, SW837:
p = 5.6e-‐22) und Dauer der Therapie (LS513: p = 9.9e-‐10, SW837: p = 1.1e-‐09). Für LS1034 zeigte sich nach Behandlung mit 100 µg/ml Trastuzumab in Kombination mit Pertuzumab eine dosisabhängig signifikante, jedoch minimale Reduktion der Zellviabilität (p = 8.9e-‐
16). Zeitabhängig lag für LS1034 kein signifikanter Effekt vor (p = 0.18) (s. Abb. 17B). Es konnte also auch durch Dosissteigerung von Trastuzumab keine phänotypisch relevante Effektivitätssteigerung auf Ebene der Zellviabilität erzielt werden.
LS513 LS1034 SW837
A
B
Abbildung 17: Western Blots (A) und Zellviabilitätsmessungen (B) nach Behandlung mit 20 bzw. 100 µg/ml Trastuzumab und Pertuzumab
3.2.3.2 Pertuzumab kombiniert mit Trastuzumab
Bei der Kombination von 1 µg/ml Pertuzumab mit einer Trastuzumab-‐Verdünnungsreihe stellte sich in allen Zelllinien eine deutliche dosisabhängige Verminderung von pAkt im Western Blot dar (s. Abb. 18A). Die alleinige Therapie mit einer Trastuzumab-‐
Verdünnungsreihe war im Vergleich dazu nicht effektiv (s. Abb. 11, S. 53). Im Zellviabili-‐
tätsassay erbrachte die Behandlung mit 1 µg/ml Pertuzumab und der Trastuzumab-‐
Verdünnungsreihe für alle Zelllinien signifikante, aber phänotypisch nur geringe Unter-‐
schiede der Zellviabilität über die Dosierung (LS513: p = 1.1e-‐16, LS1034: p = 8.7e-‐15, SW837: p = 1.8e-‐20) und die Messzeitpunkte (LS513: p = 0.015, LS1034: p = 0.006, SW837:
p =3e-‐04) (s. Abb. 18B).
LS513 LS1034 SW837
A
B
Abbildung 18: Western Blots (A) und Zellviabilitätsmessungen (B) nach Behandlung mit 1 µg/ml Pertuzumab und Trastuzumab
Im Western Blot zeigte sich in allen Zelllinien ein deutlicher Unterschied zwischen der niedrigen (1 µg/ml) und der hohen Dosis Pertuzumab (20 µg/ml für LS513, 50 µg/ml für LS1034 und 100 µg/ml für SW837) in Kombination mit einer Trastuzumab-‐
Verdünnungsreihe (s. Abb. 18A und 19A). Das bedeutet, dass eine Steigerung der Pertu-‐
zumab-‐Dosis zu einer Effektivitätssteigerung in der Inhibierung von pAkt führte. Die Kom-‐
bination von 20 µg/ml Pertuzumab mit Trastuzumab führte bei LS513 zu einem dosisab-‐
hängigen (p = 5.4e-‐20), nicht jedoch zeitabhängigen (p = 0.49) signifikanten Unterschied in der Zellviabilität. LS1034 wurde mit 50 µg/ml Pertuzumab und SW837 mit 100 µg/ml Pertuzumab in Kombination mit Trastuzumab behandelt. Dies führte über die Dosis (LS1034: p = 8.5e-‐16, SW837: p = 6.3e-‐22) und die Zeit (LS1034: p =0.015, SW837: p = 1.3e-‐05) zu einem signifikanten, jedoch phänotypisch nur geringen Unterschied der Zell-‐
viabilität (s. Abb. 19B). Im Vergleich zur Kombination von 1 µg/ml Pertuzumab mit Trastu-‐
zumab konnte auf Ebene der Zellviabilität keine Effektivitätssteigerung durch Dosissteige-‐
rung gezeigt werden (s. Abb. 18B und 19B).
LS513 LS1034 SW837 A
B
Abbildung 19: Western Blots (A) und Zellviabilitätsmessungen (B) nach Behandlung mit 20, 50 bzw. 100 µg/ml Pertuzumab und Trastuzumab
Zusammenfassend zeigte sich im Western Blot also ein deutlicher Einfluss durch Kombi-‐
nation von Pertuzumab und Trastuzumab auf das pAkt-‐Level. Im Fall der festen Konzentration von Trastuzumab gab es keinen relevanten Unterschied zwischen einer niedrigen und hohen Konzentration (s. Abb. 16A und 17A). Im Fall der festen Konzentrati-‐
on von Pertuzumab zeigte die höhere Konzentration einen deutlicheren Einfluss auf pAkt (s. Abb. 18A und 19A). Im Zellviabilitätsassay wurde zusammenfassend in allen Zelllinien nach der Behandlung mit einer Kombinationen aus Trastuzumab und Pertuzumab kein maßgeblicher Einfluss beobachtet. Selbst bei sehr hohen Antikörperkonzentrationen zeig-‐
te sich die Zellviabilität nur geringfügig vermindert. Es konnte kein relevanter Unterschied zwischen einer niedrigen und hohen Konzentration eines Antikörpers dargestellt werden (s. Abb. 16B und 17B sowie 18B und 19B).
An dieser Stelle sollte darauf hingewiesen werden, dass eine statistische Varianzanalyse der einzelnen Regressionskurven zum Vergleich der Effektivität zwischen einer Monothe-‐
rapie und einer Kombinationstherapie, wie nachfolgend für einige Kombinationen der Anti-‐HER-‐2-‐Substanzen mit 5-‐FU und Oxaliplatin durchgeführt, an dieser Stelle nicht sinn-‐
voll erscheint. Die effektive Konzentration, die theoretisch zu einer Viabilitätsverringerung von 50 % (EC50) führen würde, liegt zu jedem Zeitpunkt weit außerhalb des Messbereichs und hätte daher nur mathematisch geschätzt werden können.
3.2.4 Kombination der Anti-‐HER-‐2-‐Substanzen mit 5-‐FU und Oxaliplatin