Abb. 4: Semiquantitative PCR mit Nachweis von 18S (489 bp).
Marker = Hyper Ladder I, Kontrolle = Enthält an Stelle von cDNA nukleasefreies Wasser, 1-5 = cDNA aus 5 nativen Leberteilresektaten
Abb. 5: Semiquantitative PCR mit Nachweis von 11-HSD 1 (411 bp).
Marker = Hyper Ladder I, Kontrolle = enthält an Stelle von cDNA nukleasefreies Wasser, 1-5 = cDNA aus 5 nativen Leberteilresektaten
Abb. 6: Semiquantitative PCR mit Nachweis von H6PDH (498 bp).
Marker = Hyper Ladder I, Kontrolle = enthält an Stelle von cDNA nukleasefreies Wasser, 1-5 = cDNA aus 5 nativen Leberteilresektaten
Abb. 7: Semiquantitative PCR mit Nachweis von HES-1 (304 bp).
Marker = Hyper Ladder I, Kontrolle = enthält an Stelle von cDNA nukleasefreies Wasser, 1-5 = cDNA aus 5 nativen Leberteilresektaten
31 3.2.1 Klinische Daten und Leberfunktionsprüfungen
Die Patienten sind anhand der Leberbiopsien histologisch in Gruppen eingeteilt worden. Die Gruppen bestanden aus Individuen mit histologisch gesunder Leber (n=8), Fettleber (n=20), Leber mit Nash Grad 1 (n=22), Grad 2 (n=9), Grad 3 (n=3), sowie Zirrhose (n=3) und Hepatitiden anderer Ursache (n=10), wie z.B. Autoimmunhepatitis, Medikamenten-induzierte toxische Hepatitis und Hepatitis bei Morbus Wilson.
Patienten mit Fettleber zeigten eine größere Körperoberfläche, höhere Cholesterinwerte und einen höheren Fettgehalt der Leber als Patienten mit histologisch unauffälliger Leberbiopsie (Tabelle 9). Bei übergewichtigen und adipösen Patienten (BMI >25 kg/m2) wurden ein höherer Fettgehalt der Leber (48,9 ± 25,7 vs. 30,0 ± 22,9, p
< 0,05), höhere AST-Werte (53,9 ± 38,5 vs. 36,3 ± 17,8 U/l, p < 0.05) sowie eine erhöhte Totalexkretion der Kortisolmetabolite (12420 ± 5713 vs. 8184 ± 3518 μg/24h, p
< 0.05) im Vergleich zu denen bei schlanken Patienten (BMI <25 kg/m2) vorgefunden.
Patienten mit Insulinresistenz (HOMA-IR > 4) hatten einen erhöhten Leberfettgehalt (55,0 ± 17,0 vs 30,4 ± 16,9, p < 0,05) im Vergleich zu Patienten mit einem HOMA-IR <
4. Unterschiede im Alter, mittlerem arteriellen Druck, HDL-Cholesterin, Triglyzeriden, ALT, AST, γ-GT, AP sowie Thrombozytengehalt waren zwischen den verschiedenen Gruppen nicht zu verzeichnen.
Histologisch unauffällig
Fettleber NASH Andere
Grad 1 Grad 2 Grad 3 Hepatitis Zirrhose
Probenanzahl 7 20 22 9 3 9 3
Männlich/Weiblich 3/4 8/12 12/10 1/8 0/3 2/7 1/2 Alter (Jahre) 49,9 12,4 46,6
13,6
54,0 10,7
55,8 14,3
61,0 7,0
50,3 16,2
66,0 10,4 BMI (kg/m2) 25,5 3,0 26,9 4,1 32,1
7,8 *, #
30,7 4,5 *
27,6 3,3
28,7 10,7
29,0 2,1 Körperoberfläche
(m2)
1,82 0,13 1,89 0,23 *
2,01 0,22 *
1,94 0,21
1,80 0,07 *
1,80 0,30
1,90 0,08 Leberfettgehalt
(%)
6,7 11,8 32,9 23,3***
47,7 22,1
**, #
63,3 18,0
***,
###
76,7 5,8
37,5 37,5
20,0 10,4
MAP (mmHg) 92,7 12,0 89,5 10,8
93,2 9,6
94,3 11,1
91,0 8,5
95,2 9,5
83,3 21,2
32 Cholesterin
(mg/dl)
205 30 243 35
*
207 40 #
193 71
258 76
193 16 148 52 LDL-Cholesterin
(mg/dl)
132 19 158 32 133 40
118 37 #
157 54
120 37 107 40 HDL-Cholesterin
(mg/dl)
63 20 65 22 55 11
46 18
65 33
64 19 38 28 Triglyzeride
(mg/dl)
149 137 146 67 161 98
232 133
179 57
103 37 146 57
GPT/ALT (U/l) 80,0 82,7 59,1 35,5
73,3 39,2
70,6 78,7
21,0 12,7
84,6 89,2
63,3 49,9 GOT/AST (U/l) 45,3 28,8 36,3
16,7
45,8 19,7
46,1 30,6
45,0 26,9
67,6 43,4
112,3 96,9 γ-GT (U/l) 204 192 147 93 159
159
198 183
818 1101
114 83 160 154
AP (U/l) 112 82 112 55 101 51
121 31
364 299
103 48 240 124
Bilirubin (mg/dl) 0,81 0,31 0,71 0,30
0,71 0,25
0,50 0,18 *
1,50 0,99
0,70 0,38
11,5 10,2 Kreatinin (mg/dl) 0,94 0,14 0,88
0,16
0,91 0,21
0,72 0,19 *
0,49 0,03
0,80 0,10
1,49 1,14 Albumin (g/l) 57,9 4,2 58,3 2,9 57,3
4,6
53,8 8,5
54,9 3,2
50,9 3,0 *, #
39,3 16,1 Thrombozyten/nl 223 41 252 47 223
57
232 40
224 13
210 58 81 72
Die Insulinresistenz korrelierte signifikant positiv mit dem Leberfettgehalt. Als
Marker der Insulinresistenz sind die Parameter HOMA-IR ([Nüchterninsulin (mIE/l) x Nüchternglukose (mmol/l)]/22.5) und QUICKI ( 1/[log(Glukose)+log(Insulin)] ) bestimmt worden. Je höher der HOMA-IR oder je niedriger der QUICKI desto stärker ausgeprägt ist die Insulinresistenz beim entsprechenden Patienten. Für die Korrelation ergab sich für HOMA-IR eine Signifikanz von p < 0,05 und für QUICKI von p < 0,01 (Abb. 8).
Tabelle 9: Klinische und laborchemische Charakteristika der unterschiedlichen histologischen Gruppen der Leberbiopsien (n=73).
Es sind die arithmetischen Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) angegeben. NASH = Nicht-alkoholische Steatohepatitis. BMI = Body Mass Index. Die Körperoberfläche wurde anhand der DuBois-Formel errechnet: BSA = Gewicht (kg) 0,425x Größe (cm) 0,725x 0,007184. MAP = mittlerer arterieller Druck. AP = alkalische Phosphatase. * = p <
0,05, ** = p < 0,01, ***=p < 0,001 im Vergleich zur histologisch unauffälligen Leber; # = p < 0.05, ### = p < 0.001 im Vergleich zur Fettleber (für Gruppen mit n < 4 wurden keine Vergleiche berechnet). Normalwerte (SI-Einheiten in Klammern): Cholesterin < 200 mg/dl (5,17 mmol/l); LDL-Cholesterin < 160 mg/dl (4,14 mmol/l); HDL-Cholesterin > 35 mg/dl (0,91 mmol/l); Triglyzeride < 180 mg/dl (2,06 mmol/l); GPT/ALT < 45 U/l (750 nmol/l), GOT/AST < 50 U/l (833 nmol/l), γ-GT <55 U/l (916 nmol/l), AP 40-129 U/l, Bilirubin < 1 mg/dl (17,1 μmol/l). Umrechnungswert für Kreatinin: (mg/dl
* 88,4) = μmol/l.
33
Abb. 8: Korrelation zwischen Insulinresistenz und Leberfettgehalt
HOMA-IR = Homeostasis model assessment – insulin resistance ([Nüchterninsulin (mIE/l) x Nüchternglukose (mmol/l)]/22.5); QUICKI = 1/(log[Glukose]+log[Insulin]); Leberfettgehalt in %; QUICKI: p < 0,01; HOMA-IR: p < 0,05
3.2.2 mRNA-Expression hepatischer 11-HSD1 und H6PDH
Es zeigte sich eine starke und signifikante positive Korrelation (R2 = 0,809, p <
0,001) zwischen der mRNA-Expression von hepatischer 11-HSD1 und H6PDH (Abb.
9). Eine Korrelation zwischen mRNA-Expression von 11-HSD1 und Alter, BMI, Grad der Leberverfettung sowie NASH Stadium konnte nicht festgestellt werden. Der einzige Parameter, der die mRNA-Expression von 11-HSD1 und Fettleibigkeit zu verbinden scheint, ist die signifikant negative Korrelation zwischen 11-HSD1 mRNA-Expression (R2 = 0,285, p = 0,007) und normalisiertem geschlechtsadjustiertem Hüft-Taillen-Index (Hüft-Taillen-Index für Männer 0,9 = 100%; für Frauen 0,85 = 100%) bei Frauen, jedoch nicht bei Männern (Abb. 10).
34
Abb. 9: Korrelation zwischen mRNA-Expression hepatischer 11-HSD1 und H6PDH
(Für beide sind ΔCT-Werte dargestellt) in Leberbiopsien von 73 Patienten. Hohe ΔCT-Werte bedeuten geringe Expression und umgekehrt.
Abb. 10: Korrelation zwischen mRNA-Expression von 11-HSD1 und geschlechtsadjustiertem Hüft-Taillen-Index in %
(100% = Hüft-Taillen-Index von 0,85 bei Frauen und 0,9 bei Männern); mRNA-Expressionswerte dargestellt als ΔCT-Werte, hohe Werte bedeuten geringe Expression und umgekehrt. 11-HSD1 = 11-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1
35 Betrachtet man jedoch die gesamte Patientenkohorte so weisen Individuen mit einem Hüft-Taillen-Index > 0,9 (Maß für abdominelle Fettleibigkeit) niedrigere Werte für die hepatische mRNA-Expression von 11-HSD1 und H6PDH (11.5 ± 2.0 vs. 9.9 ± 1.1 ΔCT; p < 0.05; 12.2 ± 0.9 vs. 11.3 ± 0.5 ΔCT, p < 0.005) auf als die Patienten mit einem Hüft-Taillen-Index < 0,9 (Abb. 11).
Abb. 11: mRNA-Expression von 11-HSD1 und H6PDH bei Patienten mit (Hüft-Taillen-Index > 0,9) und ohne (Hüft-Taillen-Index < 0,9) abdomineller Adipositas.
Hohe ΔCT-Werte bedeuten geringe Expression und umgekehrt. 11-HSD1 = 11-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1; H6PDH = Hexose-6-Phosphat Dehydrogenase
Zudem zeigten Patienten mit einem Hüft-Taillen-Index > 0,9 höhere Gesamtausscheidungsraten von Kortisolmetaboliten im Urin (13971 ± 5637 vs. 8062 ± 6159 μg/24h, p < 0,05), sowie auch eine erhöhte Ausscheidung von THE (4486 ± 1727 vs. 2635 ± 1874 μg/24h, p < 0,05) im Vergleich zu Patienten mit einem Hüft-Taillen-Index von < 0,9 (Abb. 12).
36
Abb. 12: THE- und Gesamt-Kortisolmetabolitausscheidung bei Patienten mit (Hüft-Taillen-Index < 0,9) und ohne (Hüft-Taillen-Index < 0,9) abdominelle Adipositas.
Werte sind dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler. THE = Tetrahydrokortison.
In der Patientenkohorte fand sich bei Männern eine erhöhte Ausscheidung von 5-THF (2338 ± 768 vs. 1395 ± 1203 μg/24h, p < 0,05) im Vergleich zu Frauen (Abb.
13). Andere geschlechtsspezifische Unterschiede konnten nicht gefunden werden. Expression von 11-HSD1 mRNA in der Leber korrelierte weder mit dem (THF+5-THF)/THE-Quotienten im Urin noch mit dem Kortol/Kortolon-, THF/5-THF-, 5-THF/F- THF/F-Quotienten oder der Ausscheidung der Gesamt-Kortisolmetabolite.
Abb. 13: 5-THF-Ausscheidung im 24-h-Urin bei Patienten mit Taillen-Index < 0,9) und ohne (Hüft-Taillen-Index < 0,9) abdominelle Adipositas.
Werte sind dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler. 5-THF = 5-Tetrahydrokortisol.
37 3.2.3 Ausscheidung von Kortisolmetaboliten im Urin
Zwischen den verschiedenen histologischen Gruppen konnten keine Unterschiede bezüglich der Glukokortikoidkonzentrationen oder -quotienten im Urin gefunden werden. Daher wurden zur weiteren Analyse die einzelnen NASH-Untergruppen vereint, so dass nur noch eine männliche und eine weibliche Gesamtkohorte mit NASH in die folgende Statistik einflossen.
Im Vergleich zu gesunden schlanken Individuen schieden weibliche Patienten mit Fettleber und männliche Patienten mit NASH signifikant mehr Kortisolmetaboliten aus (Abb. 14).
Trotz eines signifikanten Altersunterschieds zwischen gesunden, schlanken Patienten und Patienten mit Fettleber oder NASH gab es keine Unterschiede in der Körper-Gesamtaktivität der 11-HSD1, die mit Hilfe des (THF+5-THF)/THE-Quotienten im Urin bestimmt worden ist (Abb. 15).
Abb. 14: Gesamt-Ausscheidung von Kortisolmetaboliten (μg/24h) bei gesunden Männern (n=26) und Frauen (n=34) sowie Patienten mit einer Fettlebererkrankung (11 Frauen, 2 Männer) oder NASH (11 Frauen, 5 Männer).
Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardfehler dargestellt. NASH = Nicht-alkoholische Steatohepatitis.
Gesamtkortisolmetaboliten im Urin (F) entsprechen der Summe aus Tetrahydrokortison (THE), Tetrahydrokortisol (THF), 5α-Tetrahydrokortisol (5α-THF), α-Kortolon, β-Kortolon, α-Kortol und β-Kortol.
38
Abb. 15: (THF + 5-THF)/THE-Quotient im Urin gesunder Frauen (n=34) und Männer (n=26) und bei Patienten mit Fettleber (11 Frauen, 2 Männer) sowie NASH (11 Frauen, 5 Männer).
Die Werte sind dargestellt als Mittelwert mit Standardfehler. NASH = nicht-alkoholische Steatohepatitis.
Eine Erhöhung der relativen 5- und 5-Reduktion, die anhand der 5-THF/F- und THF/F-Quotienten im Urin gemessen worden ist, fand sich bei weiblichen Patienten mit Fettleber sowie mit NASH im Vergleich zu gesunden Frauen.
Bei Männern mit Fettleber und NASH war ein Trend hin zu höheren Quotienten im Vergleich zu Männern der Kontrollgruppe zu verzeichnen. Die gesunden schlanken Männer hatten ferner höhere 5-THF/F- und THF/F-Quotienten im Urin im Vergleich zu gesunden Frauen (Abb. 16a und b).
39
Abb. 16a
Abb. 16b
Abb. 16 : a) 5-THF)/F-Quotient und b) THF/F-Quotient im Urin von gesunden Frauen (n=34) und Männern (n=26) und bei Patienten mit Fettleber (11 Frauen, 2 Männer) oder NASH (11 Frauen, 5 Männer).
Die Werte sind als Mittelwerte mit Standardfehler angegeben. NASH = nicht-alkoholische Steatohepatitis; THF = Tetrahydrokortisol; F = Kortisol. * = p < 0.05, *** = p < 0.001 gesunde Männer verglichen mit gesunden Frauen.
40 3.2.4 mRNA-Expression von 5-Reduktase
Trotz isoliert erhöhter 5-Tetrahydrokortisonwerte (5-THF) im 24h-Urin aller männlichen Patienten im Vergleich zu den Frauen, konnte keine signifikante geschlechtsspezifische Veränderung in der hepatischen mRNA-Expression der 5-Reduktase beobachtet werden. Auch zwischen den einzelnen histologischen Gruppen, zwischen adipösen (BMI > 25) und nicht-adipösen Patienten (BMI < 25), Individuen mit (HOMA-IR > 4) und ohne Insulinresistenz oder abdomineller Adipositas (Hüft-Taillen-Index > 0,9) gab es keine Unterschiede in deren Expression.
Es fand sich in der Gesamtgruppe aller untersuchten Patienten eine negative Korrelation zwischen der mRNA-Expression von Reduktase und der Größe des 5-THF/F-Quotienten im Urin (R² = 0,126, p < 0,05, Abb. 17).
Abb. 17: Korrelation zwischen mRNA-Expression von 5-Reduktase und Urin-5-THF/F-Quotient
mRNA-Expression ist dargestellt als ΔCT-Werte; hohe ΔCT-Werte entsprechen geringer Expression und umgekehrt;
THF = Tetrahydrokortisol, F = Kortisol
41 3.2.5 mRNA-Expression von HES-1
Zwar gibt es in der Literatur Hinweise auf den Zusammenhang zwischen HES-1 und der Entwicklung einer Fettleber [23, 24], jedoch konnte in der hier untersuchten Patientenkohorte kein Zusammenhang zwischen der hepatischen mRNA-Expression von HES-1 und dem prozentualen Leberfettgehalt gefunden werden. Eine signifikante Korrelation fand sich allerdings mit LDL-Werten (R2 = 0,116; p = 0,05), Cholesterin (R2 = 0,176; p = 0,015) und dem Hüft-Taillen-Index der Patienten (R2 = 0,134;p < 0,05) (Abb.
18 und 19). Bei sinkender HES-1 mRNA-Expression (entspricht steigenden ΔCT-Werten) stiegen alle drei Parameter an.
Abb. 18: Korrelation ΔCT HES-1 und Hüft-Taillen-Index
mRNA-Expression dargestellt als ΔCT-Werte; hohe Werte entsprechen geringer Expression und umgekehrt.
HES-1 = Hairy and enhancer of split 1
42 3.3 Kohorte 2: Subanalyse von Patienten mit Fettleber
3.3.1 Klinische Charakteristika
In dieser Subanalyse wurden Patienten mit NASH ausgeschlossen und nur Patienten mit NAFLD analysiert. Die pathologische Klassifikation ergab 7 Patienten (3 Männer, 4 Frauen) mit unauffälliger und 20 Patienten (8 Männer, 12 Frauen) mit verfetteter Leber. Die histologische Diagnose der Fettleber zeigte keinen Zusammenhang mit dem Geschlecht. Es gab zwischen den zwei Patientengruppen keine signifikanten Unterschiede im Alter, HOMA-IR, HDL- oder LDL-Cholesterin, den Triglyzeriden, den Leberenzymen oder dem Hüft-Taillen-Index. Bei Patienten mit verfetterter Leber fanden sich ein signifikant erhöhter Leberfettgehalt (32,9 ± 23,3 % vs.
6,7 ± 7,5 %; p = 0,013; Abb. 20) sowie höhere Gesamtcholesterinwerte (243 ± 35 mg/dl vs. 205 ± 30 mg/dl; p < 0,05) als bei den gesunden Individuen.
Abb. 19: Korrelation ΔCT HES-1 und LDL- sowie Cholesterinwerte
mRNA-Expression dargestellt als ΔCT-Werte; hohe Werte entsprechen geringer Expression und umgekehrt.
LDL = low density Lipoprotein; HES-1 = Hairy and enhancer of split 1
43 3.3.2 mRNA-Expression von G6Pase und G6PT
Abb. 20: Leberfettgehalt Kontrollgruppe vs.
NAFLD
Leberfettgehalt in % bei Patienten der Kontrollgruppe (n=8) und Patienten mit NAFLD (n=20). Werte dargestellt als Mittelwert mit Standartfehler. NAFLD = Fettleber.
Abb. 21: m-RNA Expression Kontrollgruppe (n=8) vs. NAFLD (n=22)
mRNA-Expression dargestellt als ΔCT-Mittelwerte. Expression der Kontrollen wurde gleich 1 gesetzt. NAFLD = Fettleber, G6Pase = Glukose-6-Phosphatase alpha, G6PT = Glukose-6-Phosphat Transporter
Abb. 22: Korrelation zwischen mRNA-Expression G6Pase und G6PT
mRNA-Expression dargestellt als ΔCT-Werte; hohe Werte bedeuten niedrige Expression und umgekehrt.
R2 = 0,406; p < 0,05; G6Pase = Glukose-6-Phosphatase alpha, G6PT
= Glukose-6-Phosphat Transporter
44 Bei Patienten mit der Diagnose Fettleber fand sich eine signifikante Herunterregulation der G6Pase-mRNA-Expression (p < 0.05) auf 38% und des G6PT auf 55% (p < 0,05; Abb. 21) im Vergleich zu Patienten mit unauffälliger Leberhistologie.
Die G6Pase-mRNA-Expression korrelierte positiv mit der mRNA-Expression von G6PT (R² = 0,406; p < 0,05; Abb. 22) und negativ mit Serum-Billirubinwerten (R2 = 0,128, p <
0,05; Abb. 23). Es fanden sich keine Korrelationen zwischen den mRNA-Expressionen beider Gene und dem Alter der Patienten, deren BMI, GPT, GOT, AP, γ-GT, Triglyzeriden und Glukosespiegeln.
Abb. 23: Korrelation mRNA-Expression G6Pase und Serum-Bilirubinwerte
mRNA-Expression dargestellt als ΔCT-Werte; hohe Werte bedeuten niedrige Expression und umgekehrt. Serum-Bilirubin in mg/dl. R2 = 0,128; p < 0,05;
G6Pase = Glukose-6-Phosphatase alpha
45 4. DISKUSSION