Klonierungen

Klonierung von RNMTL1-Mutanten in lentivirale Vektor

Zur Transduktion von RNMTL1-Konstrukten in HepG2-Zellen wurden die RNMTL1-Mutanten Del-MTS, Del-NTerm und Del-L7Ae, sowie der RNMTL1-Wildtyp (Wt), in den lentiviralen Vektor pCDH kloniert. Die Deletionsmutationen wurden über PCR (siehe 2.2.1.3) generiert und alle DNA-Fragmente amplifiziert. Dabei wurden die forward Primer (Tab. 2-12) so gewählt, dass die RNMTL1-Sequenz entsprechend der

Material und Methoden

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gewählten Deletion verkürzt wurden. Über den reverse Primer wurde ein V5- und His-Tag am 3’Ende angefügt. Der Ausgangsvektor mit der RNMTL1-Sequenz wurde von Niels-Peter Becker zur Verfügung gestellt. Die PCR-Reaktionen wurde danach gelelektrophoretisch aufgetrennt (siehe 2.2.1.4) und die Amplifikate mit dem Perfectprep Gel Cleanup Kit entsprechend der Herstellerangaben aus dem Agarosegel eluiert. Für die Subklonierung der Amplifikate in den pGEM-T Easy Vektor war die Generierung von A-Überhängen erforderlich. Das A-tailing der Amplifikate erfolgte bei 72°C für 30 min (siehe 2.2.1.5). Die Amplifikate wurden nun mit dem Vektor bei 4°C über Nacht ligiert (siehe 2.2.1.5). Anschließend wurden DH5α E.coli Bakterien mit dem Ligationsansatz transformiert (siehe 2.2.1.6), Übernachtkulturen angesetzt und aus diesen am folgenden Tag die Plasmide isoliert (siehe 2.2.1.7) und anschließend sequenziert (siehe 2.2.1.8). Zur Vervielfältigung einer positiv getesteten Plasmid-DNA wurde von der entsprechenden Bakterienkolonie eine 50 ml Übernachtkultur angesetzt. Am folgenden Tag wurde die Plasmid-DNA isoliert (siehe 2.2.1.7) und die DNA-Konzentration am NanoDrop 1000 bestimmt. Nun erfolgte ein präparativer Restriktionsverdau (siehe 2.2.1.9) der vier verschiedenen Konstrukte und des Zielvektors pCDH (zur Verfügung gestellt von Niels-Peter Becker) jeweils mit EcoRI. Dieses schneidet auf beiden Seiten des Polylinkers des pGEM-T Easy. Die Restriktionsansätze wurden mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und die gewünschten DNA-Fragmente aus dem Gel eluiert (s.o.). Alle vier RNMTL1-Fragmente wurden jeweils in den geschnittenen dephosphorylierten (siehe 2.2.1.9) Vektor pCDH ligiert, die Konstrukte anschließend in DH5α E.coli Bakterien transformiert, eine Plasmid-Mini-Präparation durchgeführt und die Plasmid-DNA-Konzentration bestimmt (s.o.). Zuletzt wurden die Proben sequenziert und positiv getestete DNA über eine Plasmid-Midi-Präparation vervielfältigt (s.o). Die Plasmid-Proben wurden bis zum weiteren Gebrauch bei -20°C konserviert.

Tabelle 2-12: Primersequenzen für Klonierung von RNMTL1-Konstrukten in lentivrialen pCDH

Primername Primersequenz

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Klonierung von RNMTL1-Mutanten in pcDNA3.1/V5-His-TOPO

Um, die zuvor in den lentiviralen Vektor zur Transduktion eingebrachten, RNMTL1-Mutanten (siehe vorherigen Abschnitt) in HepG2-Zellen alternativ stabil zu transfizieren, wurden diese in den Vektor pcDNA3.1/V5-His-TOPO kloniert. Dazu diente das Konstrukt RNMTL1-Wt-pCDH als Ausgangsvektor. Die Deletionsmutanten wurden wie oben beschrieben, über PCR (siehe 2.2.1.3) mithilfe entsprechender Primer generiert, die zudem eine BamHI- und EcoRI-Schnittstelle an den Enden anfügten (Tab. 2-13). Die PCR-Reaktionen wurden wie oben beschrieben gelelektrophoretisch aufgetrennt und die Amplifikate aus dem Agarosegel eluiert (siehe 2.2.1.4). Sowohl die Amplifikate als auch der Vektor wurden nun direkt mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut. Der Vektor wurde anschließend dephosphoryliert (siehe 2.2.1.9). Die Ansätze wurden erneut über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, die DNA-Fragmente aus dem Gel eluiert, die Konzentration bestimmt und RNMTL1-Fragmente jeweils mit dem linearisierten Vektor ligiert (s.o.). Es folgte die Transformation der Ligationsansätze in DH5α E.coli mit anschließender Plasmid-Mini-Präparation, eine Restriktionsanalyse und Sequenzierung der isolierten Konstrukte sowie die Vervielfältigung positiv getesteter Konstrukte (s.o.). Diese wurden bei -20°C gelagert.

Tabelle 2-13: Primersequenzen für Klonierung von RNMTL1-Konstrukten in pcDNA3.1/V5-His-TOPO

Primername Primersequenz

BamHI_RNMTL1_Fwd (Wt) ATGCGGATCCCAGGGAACATGGCGGCGCTGGTGAGACC BamHI_RNMTL1_DelMTS_Fwd CGC ATGCGGATCCCAGGGAACATGCCAGTGAAAGTGGTGTTT BamHI_RNMTL1_DelNTERM_Fwd ATGCGGATCCCAGGGAACATGGAAGAGTCTGGGCTTCGCC

TACGATAAAG

BamHI_RNMTL1_DelL7Ae_Fwd ATGCGGATCCCAGGGAACATGGCCAAGCCTGACCATGTT AAG

EcoRI_V5_6HIS_RNMTL1_Rev ATGCGAATTCTTGTGGTAACTCCTGTCCCTGCTCAAGTC

Klonierung von RNMTL1 und Secp43 in den Expressionsvektor pET52b(+)

Zur rekombinanten Expression von RNMTL1 und SECp43 wurden diese in den Expressionsvektor pET52b(+) kloniert. Die Sequenz von RNMTL1 wurde aus dem Ausgangsvektor RNMTL1-Wt-pCDH und die Secp43-Sequenz aus der HepG2-cDNA

Material und Methoden

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(zur Verfügung gestellt von Dr. Peter Hofmann) mittels PCR amplifziert (siehe 2.2.1.3). Da der C-terminale His-Tag für die Aufreinigung verwendet wurde, wurde der N-terminale Strep-Tag II aus der Vektorsequenz über entsprechend gewählte forward Primer entfernt (Tab. 2-14). Die PCR-Ansätze wurden in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und aus dem Gel eluiert (s.o.). Anschließend wurde das RNMTL1-Fragment mit ClaI und SacI und das Secp43-Fragment mit XbaI und SacI an den durch die PCR jeweils angefügten Schnittstellen verdaut (s.o.).

Entsprechend wurde auch jeweils der Vektor verdaut. Dieser musste für den Verdau mit ClaI zuvor in einen dam^-- E.coli-Stamm transformiert werden, da ClaI nur an unmethylierten (dam^-) Schnittstellen schneiden kann. Nach Plasmidpräparation und Konzentrationbestimmung (s.o.), wurden die beiden Fragmente jeweils in den Vektor ligiert. Der Ligationsansatz wurde in DH5α E.coli transformiert, gefolgt von einer Plasmid-Mini-Präparation mithilfe des Wizard Plus Minipreps DNA Purification System. Danach wurde die DNA-Konzentration bestimmt und die Plasmid-DNA sequenziert (s.o.). Zur anknüpfenden Proteinexpression wurden positiv getestete Konstrukte in BL21 StarT™ (DE3) E.coli Baktierien transformiert.

Tabelle 2-14: Primersequenzen für Klonierungen in den Expressionsvektor pET52b(+) Primername Primersequenz

Für die Synthese eines in vitro Transkripts zur anschließenden in vitro Translation von SECp43 wurde die Secp43-DNA-Sequenz aus dem Plasmidkonstrukt pET-52b(+)-Secp43 mittels PCR (siehe 2.2.1.3) amplifiziert. Zur Kontrolle der Integrität des Amplifikats wurde 1 µl der Reaktion über ein Agarosegel (siehe 2.2.1.4) aufgetrennt. Anschließend erfolgte die Aufreinigung des PCR-Produkts mithilfe der Phenol-Chloroform-Extraktion. Der PCR-Reaktionsansatz wurde dabei mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Gemisch in einem Verhältnis von 25:24:1 versetzt und gut gemischt, bis sich eine Emulsion gebildet hatte. Danach