Klonierung verschiedener Plasmide

• pVG19 (PMT1^HA R64A in YEp352)

Fusion des mutierten Enzyms Pmt1p R64A mit einem 6x HA-Epitop: Die Plasmide pSB105 (PMT1 R64A in YEp352) und pVG13 (PMT1^HA ∆304-531 in YEp352) wurden mit den Restriktionsenzymen CpoI und XhoI präparativ verdaut. Von dem Restriktionsansatz pVG13 wurde ein 436 bp Fragment, das die DNA-Sequenz für das 6x HA-Epitop enthält, isoliert und in den aufgeschnittenen Vektor pSB105 ligiert. Daraus folgte Plasmid pVG19 (PMT1^HA R64A in YEp352).

• pVG22 (PMT1^HA E426A in YEp352)

PMT1 Mutagenese E426A: Die Mutagenese wurde mit Hilfe des "GeneEditor™ in vitro Site-Directed Mutagenesis" Systems von Promega nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Reaktion erfolgte mit dem Oligonukleotid vg18 an dem Plasmid pMT5 (PMT1 HindIII Fragment in pUC19). Eine Sequenzanalyse des mutagenisierten Plasmids (pVG24) bestätigte den korrekten Basenaustausch. pVG24 wurde mit HindIII verdaut, das 780 bp Fragment isoliert und in pVG13 (PMT1^HA ∆304-531 in YEp352), das ebenfalls mit HindIII verdaut wurde, ligiert. Daraus folgte Plasmid pVG22 (PMT1^HA E426A in YEp352).

• pVG23 (PMT1^HA D368A in YEp352)

PMT1 Mutagenese D368A: Die Mutagenese wurde mit Hilfe des "GeneEditor™ in vitro Site-Directed Mutagenesis" Systems von Promega nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Reaktion erfolgte mit dem Oligonukleotid 262 an dem Plasmid pMT5 (PMT1 HindIII Fragment in pUC19). Eine Sequenzanalyse des mutagenisierten Plasmids (pVG25) bestätigte den korrekten Basenaustausch. pVG25 wurde mit HindIII verdaut, das 780 bp Fragment isoliert und in pVG13 (PMT1^HA ∆304-531 in YEp352), das ebenfalls mit HindIII verdaut wurde, ligiert. Daraus folgte Plasmid pVG23 (PMT1^HA D368A in YEp352).

• pVG30 (PMT1^HA L479A in YEp352)

PMT1 Mutagenese L479A: Die Mutagenese wurde mit Hilfe des "GeneEditor™ in vitro Site-Directed Mutagenesis" Systems von Promega nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Reaktion erfolgte mit dem Oligonukleotid 276 an dem Plasmid pMT5 (PMT1 HindIII Fragment in pUC19). Eine Sequenzanalyse des mutagenisierten Plasmids (pVG27) bestätigte den korrekten Basenaustausch. pVG27 wurde mit HindIII verdaut, das 780 bp Fragment isoliert und in pVG13 (PMT1^HA ∆304-531 in YEp352), das ebenfalls mit HindIII verdaut wurde, ligiert. Daraus folgte Plasmid pVG30 (PMT1^HA L479A in YEp352).

• pVG31 (PMT1^HA L345A in YEp352)

PMT1 Mutagenese L345A: Die Mutagenese wurde mit Hilfe des "GeneEditor™ in vitro Site-Directed Mutagenesis" Systems von Promega nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Reaktion erfolgte mit dem Oligonukleotid 272 an dem Plasmid pMT5 (PMT1 HindIII Fragment in pUC19). Eine Sequenzanalyse des mutagenisierten Plasmids (pVG34) bestätigte den korrekten Basenaustausch. pVG34 wurde mit HindIII verdaut, das 780 bp Fragment isoliert und in pVG13 (PMT1^HA ∆304-531 in YEp352), das ebenfalls mit HindIII verdaut wurde, ligiert. Daraus folgte Plasmid pVG31 (PMT1^HA L345A in YEp352).

• pVG32 (PMT1^HA L314A in YEp352)

PMT1 Mutagenese L314A: Die Mutagenese wurde mit Hilfe des "GeneEditor™ in vitro Site-Directed Mutagenesis" Systems von Promega nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Reaktion erfolgte mit dem Oligonukleotid 270 an dem Plasmid pMT5 (PMT1 HindIII Fragment in pUC19). Eine Sequenzanalyse des mutagenisierten Plasmids (pVG33) bestätigte den korrekten Basenaustausch. pVG33 wurde mit HindIII verdaut, das 780 bp Fragment isoliert und in pVG13 (PMT1^HA ∆304-531 in YEp352), das ebenfalls mit HindIII verdaut wurde, ligiert. Daraus folgte Plasmid pVG32 (PMT1^HA L314A in YEp352).

• pVG35 (PMT1^HA H292A in YEp352)

PMT1 Mutagenese H292A: Für die Mutagenese mit dem "GeneEditor™ in vitro Site-Directed Mutagenesis" System von Promega wurde ein 753 bp PstI/EcoRI Fragment aus pSB53 (PMT1 in YEp352) isoliert und in pUC19 (PstI/EcoRI) ligiert. Das daraus resultierende Plasmid pFH1 wurde zusammen mit dem Oligonukleotid 260 in die Mutagenesereaktion eingesetzt. Eine Sequenzanalyse des mutagenisierten Plasmids (pVG92) bestätigte den korrekten Basenaustausch.

pVG92 wurde mit KpnI/PstI verdaut, das 585bp Fragment isoliert und in pSB56 (PMT1^HA in YEp352), das ebenfalls mit KpnI/PstI verdaut wurde, ligiert. Daraus folgte Plasmid pVG35 (PMT1^HA H292A in YEp352).

• pVG38 (PMT6^myc in YEp352)

Fusion des 9x Epitops an PMT6: In den Vektor pJK6 (Klar, 1999) wurden neun c-myc-Epitope eingeführt. Dazu wurde mit den Oligonukleotiden vg25 und vg26 die 9x myc-Sequenz über PCR aus dem Plasmid p9xMYC amplifiziert, das PCR-Produkt mit SacII verdaut und in die SacII-Schnittstelle des Vektors pJK6 kloniert. Daraus folgte Plasmid pVG38 (PMT6^myc in YEp352).

• pVG51 (PMT1^HA R138E/D189R in YEp352)

PMT1 Mutagenese R138E/D189R: Ein 729 bp Bsp1407I/KpnI Fragment wurde aus dem Plasmid pVG50 (pGEM T-easy mit PCR-Mutageneseprodukt D189R) isoliert und in pVG41 (PMT1^HA R138E in YEp352), das ebenfalls mit Bsp1407I/KpnI verdaut wurde, ligiert. Daraus folgte Plasmid pVG51 (PMT1^HA R138E/D189R in YEp352).

• pVG52 (PMT1^HA D189R in YEp352)

PMT1 Mutagenese D189R: In einem ersten PCR-Schritt wurden mit den Oligonukleotidpaaren vg41/vg42 bzw. vg40/195 und dem Plasmid pSB56 (PMT1^HA in YEp352) als DNA-Vorlage, zwei DNA-Fragmente (483 bp bzw. 767 bp) amplifiziert. In einem zweiten Schritt wurden die PCR-Produkte aus der ersten Reaktion als Megaprimer in die PCR eingesetzt und mit den beiden äußeren Primern vg42/195 nochmals amplifiziert (entspricht PMT1-Sequenz bp +97 bis +1326).

Das 1230 bp Produkt wurde in den Vektor pGEM T-easy kloniert und sequenziert. Das daraus resultierende Plasmid pVG50 wurde mit Bsp1407I/KpnI verdaut, das 729 bp Fragment isoliert und in pSB56 (PMT1^HA in YEp352), das mit den selben Restriktionsenzymen geschnitten wurde, ligiert.

Daraus folgte Plasmid pVG52 (PMT1^HA D189R in YEp352).

• pVG53 (PMT1^HA E176R in YEp352)

PMT1 Mutagenese E176R: In einem ersten PCR-Schritt wurden mit den Oligonukleotidpaaren vg39/vg42 bzw. vg38/195 und dem Plasmid pSB56 (PMT1^HA in YEp352) als DNA-Vorlage, zwei DNA-Fragmente (444 bp bzw. 804 bp) amplifiziert. In einem zweiten Schritt wurden die PCR-Produkte aus der ersten Reaktion als Megaprimer in die PCR eingesetzt und mit den beiden äußeren Primern vg42/195 nochmals amplifiziert (entspricht PMT1-Sequenz bp +97 bis +1326).

Das 1230 bp Produkt wurde in den Vektor pGEM T-easy kloniert und sequenziert. Das daraus

resultierende Plasmid pVG49 wurde mit Bsp1407I/KpnI verdaut, das 729 bp Fragment isoliert und in pSB56 (PMT1^HA in YEp352), das mit den selben Restriktionsenzymen geschnitten wurde, ligiert.

Daraus folgte Plasmid pVG53 (PMT1^HA E176R in YEp352).

• pVG57 (PMT1^HA R138E/E176R in YEp352)

PMT1 Mutagenese R138E/E176R: Ein 729 bp Bsp1407I/KpnI Fragment wurde aus dem Plasmid pVG53 (pGEM T-easy mit PCR-Mutageneseprodukt E176R) isoliert und in pVG41 (PMT1^HA R138E in YEp352), das ebenfalls mit Bsp1407I/KpnI verdaut wurde, ligiert. Daraus folgte Plasmid pVG57 (PMT1^HA R138E/E176R in YEp352).

• pVG64 (PMT1^HA H411A in YEp352)

Fusion des mutierten Enzyms Pmt1p H411A mit einem 6x HA-Epitop: Die Plasmide pSB102 (PMT1 H411A in YEp352) und pVG13 (PMT1^HA ∆304-531 in YEp352) wurden mit den Restriktionsenzymen CpoI und XhoI präparativ verdaut. Von dem Restriktionsansatz pVG13 wurde ein 436 bp Fragment, das die DNA-Sequenz für das 6x HA-Epitop enthält, isoliert und in den aufgeschnittenen Vektor pSB102 ligiert. Daraus folgte Plasmid pVG64 (PMT1^HA H411A in YEp352).

• pVG81 (PMT2^HA R79E in YEp352)

PMT2 Mutagenese R79E: In einem ersten PCR-Schritt wurden mit den Oligonukleotidpaaren vg53/vg64 bzw. vg54/63 und dem Plasmid pVG80 (PMT2^HA in YEp352) als DNA-Vorlage, zwei DNA-Fragmente (399 bp bzw. 1207 bp) amplifiziert. In einem zweiten Schritt wurden die PCR-Produkte aus der ersten Reaktion als Megaprimer in die PCR eingesetzt und mit den beiden äußeren Primern vg63/64 nochmals amplifiziert (entspricht PMT2-Sequenz bp -146 bis +1422).

Das PCR-Produkt wurde mit MluI/XhoI verdaut und das 536 bp Fragment in pVG80 (PMT2^HA in YEp352), das mit den selben Restriktionsenzymen geschnitten wurde, ligiert. Eine Sequenzanalyse des daraus resultierenden Plasmids pVG81 (PMT2^HA R79E in YEp352) bestätigte den korrekten Basenaustausch.

• pVG82 (PMT2^HA R152E in YEp352)

PMT2 Mutagenese R152E: In einem ersten PCR-Schritt wurden mit den Oligonukleotidpaaren vg55/vg64 bzw. vg56/63 und dem Plasmid pVG80 (PMT2^HA in YEp352) als DNA-Vorlage, zwei DNA-Fragmente (983 bp bzw. 623 bp) amplifiziert. In einem zweiten Schritt wurden die PCR-Produkte aus der ersten Reaktion als Megaprimer in die PCR eingesetzt und mit den beiden äußeren Primern vg63/64 nochmals amplifiziert (entspricht PMT2-Sequenz bp -146 bis +1422).

Das PCR-Produkt wurde MluI/XhoI verdaut und das 536 bp Fragment in pVG80 (PMT2^HA in YEp352), das mit den selben Restriktionsenzymen geschnitten wurde, ligiert. Eine Sequenzanalyse des daraus resultierenden Plasmids pVG82 (PMT2^HA R152E in YEp352) bestätigte den korrekten Basenaustausch.

• pVG83 (PMT2^HA R198E in YEp352)

PMT2 Mutagenese R198E: In einem ersten PCR-Schritt wurden mit den Oligonukleotidpaaren vg59/vg64 bzw. vg60/63 und dem Plasmid pVG80 (PMT2^HA in YEp352) als DNA-Vorlage, zwei DNA-Fragmente (848 bp bzw. 756 bp) amplifiziert. In einem zweiten Schritt wurden die PCR-Produkte aus der ersten Reaktion als Megaprimer in die PCR eingesetzt und mit den beiden äußeren Primern vg63/64 nochmals amplifiziert (entspricht PMT2-Sequenz bp -146 bis +1422).

Das PCR-Produkt wurde MluI/MunI verdaut und das 904 bp Fragment in pVG80 (PMT2^HA in YEp352), das mit den selben Restriktionsenzymen geschnitten wurde, ligiert. Eine Sequenzanalyse des daraus resultierenden Plasmids pVG83 (PMT2^HA R198E in YEp352) bestätigte den korrekten Basenaustausch.

• pVG84 (PMT2^HA E190R in YEp352)

PMT2 Mutagenese E190R: In einem ersten PCR-Schritt wurden mit den Oligonukleotidpaaren vg57/vg64 bzw. vg58/63 und dem Plasmid pVG80 (PMT2^HA in YEp352) als DNA-Vorlage, zwei DNA-Fragmente (871 bp bzw. 733 bp) amplifiziert. In einem zweiten Schritt wurden die PCR-Produkte aus der ersten Reaktion als Megaprimer in die PCR eingesetzt und mit den beiden äußeren Primern vg63/64 nochmals amplifiziert (entspricht PMT2-Sequenz bp -146 bis +1422).

Das PCR-Produkt wurde MluI/MunI verdaut und das 904 bp Fragment in pVG80 (PMT2^HA in YEp352), das mit den selben Restriktionsenzymen geschnitten wurde, ligiert. Eine Sequenzanalyse des daraus resultierenden Plasmids pVG84 (PMT2^HA E190R in YEp352) bestätigte den korrekten Basenaustausch.

• pVG85 (PMT2^HA D203R in YEp352)

PMT2 Mutagenese D203R: In einem ersten PCR-Schritt wurden mit den Oligonukleotidpaaren vg61/vg64 bzw. vg62/63 und dem Plasmid pVG80 (PMT2^HA in YEp352) als DNA-Vorlage, zwei DNA-Fragmente (833 bp bzw. 776 bp) amplifiziert. In einem zweiten Schritt wurden die PCR-Produkte aus der ersten Reaktion als Megaprimer eingesetzt und mit den beiden äußeren Primern vg63/64 nochmals amplifiziert (entspricht PMT2-Sequenz bp -146 bis +1422). Das PCR-Produkt wurde MluI/MunI verdaut und das 904 bp Fragment in pVG80 (PMT2^HA in YEp352), das mit den selben Restriktionsenzymen geschnitten wurde, ligiert. Eine Sequenzanalyse des daraus resultierenden Plasmids pVG85 (PMT2^HA D203R in YEp352) bestätigte den korrekten Basenaustausch.

• pVG87 (PMT2 Teilsequenz in pGEM T-easy)

DNA-Sequenzanalyse des PMT2 ORF: Für die Amplifikation eines 664 bp Fragments mit den Oligonukleotiden vg63 und vg64 wurde die genomische DNA des Hefestammes SEY6210 als Vorlage eingesetzt. Das PCR-Produkt (PMT2-Sequenz von bp -147 bis +517) wurde in den Vektor pGEM^®-T Easy ligiert.

• pVG88 (PMT2 Teilsequenz in pGEM T-easy)

DNA-Sequenzanalyse des PMT2 ORF: Für die Amplifikation eines 664 bp Fragments mit den Oligonukleotiden vg63 und vg64 wurde die genomische DNA des Hefestammes W303-1A als Vorlage eingesetzt. Das PCR-Produkt (PMT2-Sequenz von bp -147 bis +517) wurde in den Vektor pGEM^®-T Easy ligiert.

• pVG89 (PMT2 Teilsequenz in pGEM T-easy)

DNA-Sequenzanalyse des PMT2 ORF: Für die Amplifikation eines 664 bp Fragments mit den Oligonukleotiden vg63 und vg64 wurde die genomische DNA des Hefestammes BY4742 als Vorlage eingesetzt. Das PCR-Produkt (PMT2-Sequenz von bp -147 bis +517) wurde in den Vektor pGEM^®-T Easy ligiert.

• pVG90 (PMT2 Teilsequenz in pGEM T-easy)

DNA-Sequenzanalyse des PMT2 ORF: Für die Amplifikation eines 664 bp Fragments mit den Oligonukleotiden vg63 und vg64 wurde die genomische DNA des Hefestammes S288c als Vorlage eingesetzt. Das PCR-Produkt (PMT2-Sequenz von bp -147 bis +517) wurde in den Vektor pGEM^® -T Easy ligiert.

2.2.3 Proteinbiochemische Methoden