Proteine können durch Fusion mit fluoreszierenden Proteinen für die Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Die Tendenz zur Multimerisierung solcher fluoreszierender Proteine stellt ein Problem bei der Lokalisierung der Fusionsproteine dar. So kann es zur Bildung intrazellulärer Aggregate kommen (MIZUNO et al., 2001).
CAMPBELL et al. (2002) berichteten erstmals über ein monomeres rot fluoreszierendes Protein (mRFP). Dieses wurde in dieser Arbeit als Tag für das Protein P01_orf1033 eingesetzt. P01_orf1033 wurde in den Vektor pKV kloniert, in welchem mRFP integriert war. mRFP war in pKV von den Schnittstellen für EcoRI und SmaI am 5’-Ende und BamHI am 3’-Ende eingeramt. Die Insertion von P01_orf1033 erfolgte zwischen der EcoRI und der SmaI-Schnittstelle, am 5’-Ende von mRFP.
3.5.1 Amplifikation von P01_orf1033 über PCR
Entsprechend der DNA-Sequenz des P01_orf1033 wurden Oligonucleotide ausgewählt (siehe Kap. 2.3). Diese enthielten in einem Fall die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme EcoRI und ApaI bzw im anderen Fall die Schnittstelle für EcoRI und ein glattes Ende. Mittels der Technik der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) wurde das P01_orft1033-Fragment wie in Kap. 2.9.1 beschrieben mit diesen Oligonukleotiden amplifiziert. Als Matrizen-DNA wurde das Cosmid pcos MPP1 (WENZEL & HERRMANN, 1989) (siehe Kap. 2.2) eingesetzt.
Die PCR-Produkte wurden auf ein 0,8 %iges Agarosegel aufgetragen, das Gel ist in Abb. 3.5.1 dargestellt.
Die PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
PCR-Ansatz:
PWO-Polymerase 1 U
Template-DNA (100 µg/ml) 0,5 µl
DMSO 5 µl
Oligo P01 FW (10 pmol/µl) 4 µl Oligo P01 RV (10 pmol/µl) 4 µl
dNTP (10 mM) 1 µl
MgSO4 (25 mM) 8 µl
PWO-Raktionspuffer (10 ×) 5 µl
H2Obidest. ad 50 µl
Abb. 3.5.1: Ergebnis der Amplifizierung des P01_orf1033-Fragments durch PCR Es wurden 5 µl des PCR-Ansatzes auf ein 0,8 %iges Agarosegel aufgetragen. Die PCR mit den Oligonucleotiden P01-FW-EcoRI und P01-RV-ApaI ergab ein Fragment von ca. 3,5 kb.
3.5.2 Klonierung des Fragmentes P01_orf1033 in pKVmRFP
Der Vektor pKVmRFP und das PCR-Produkt P01_orf 1033 wurden zunächst mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten und nach der Ligation (siehe Kap. 2.9.3) für die Transformation von E. coli Top 10-Zellen eingesetzt (siehe Kap. 2.9.5). pKVmRFP codiert für eine Ampicillin-Resistenz. Die Transformationsansätze wurden auf LB-Amp-Platten ausgestrichen. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Kolonien wurde gemäß Kapitel 2.9.6.1 präpariert und ungeschnitten auf ein 0,8 %iges Agarosegel aufgetragen. Als Referenz diente der ungeschnittene Vektor pKVmRFP. Klone, deren Plasmid-DNA im Gel ein höheres Molekulargewicht aufwies als pKVmRFP, wurden für die Restriktionsanalyse ausgewählt. In Abb. 3.5.2 ist exemplarisch eines dieser Plasmide im Gel dargestellt. Zum Vergleich ist daneben der ungeschnittene Vektor dargestellt. Die weiteren im Vergleich zu pKVmRFP größeren Plasmide liefen im Gel alle in gleicher Höhe. Die Zellen aller zugehörigen Klone zeigten rote Fluoreszenz bei Anregung mit UV- Licht unter Verwendung des Filtersatzes 43 (siehe Kap. 2.6.3).
Abb. 3.5.2: Aus der Transformation mit dem mit P01_orf1033 ligierten Vektor pKVmRFP erhaltenes Plasmid und Ze llen des zugehörigen Klons im Fluoreszenztest Es wurden 2 µl der Plasmidpräparation bzw der Vektor-Arbeitslösung auf ein 0,8 %iges Agarosegel aufgetragen. In a ist exemplarisch eines der erhaltenen Plasmide dargestellt, in b der ungeschnittene Vektor pKVmRFP. Zellen des Klons wurden auf Platte angezogen. Etwas Zellmaterial wurde von der Platte auf einen Objektträger überführt und fluoreszenzmikroskopisch untersucht. In c ist das Phasenkontrastbild dargestellt, in d das Fluoreszenzsignal des selben Ausschnittes wie in c.
a b
10 kb 3,5 kb
c d
3.5.3 Nachweis des P01_orf1033-Proteins in den transformierten E. coli-Zellen mittels Western-Blot
Die erhaltenen fluoreszierenden Klone wurden mittels Western-Blot auf die Expression des P01_orf1033-Proteins getestet. Es wurde Zellextrakt unter denaturierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet (siehe Kap. 2.10.3). Als Kontrolle wurden auf dem Gel zusätzlich ein fluoreszenznegativer Klon sowie M. pneumoniae- Zellextrakt aufgetragen. Die mit dem Serum reagierenden Banden wurden durch Alkalische-Phosphatase-Reaktion sichtbar gemacht (siehe Kap. 2.10.4). Die gefärbte Nitrocellulosemembran ist in Abb. 3.5.3 dargestellt. Der M. pneumoniae- Zellextrakt zeigt zeigt eine Hauptbande bei ca 150 kDa und schwächere kleinere Banden, die wahrscheinlich von Protein-Abbauprodukten herrühren. Das P01_orf1033-Protein hat laut Vorhersage ein relatives Molekulargewicht von 118000, läuft aber im Gel bei höherem Molekulargewicht (ca 150 kDa) und bildet Dimere (REGULA, 1999). Die hier mit M. pneumoniae-Zellextrakt erhaltene Bande bei ca 150 kDa entspricht der erwarteten Monomer-Bande. Die positiven E. coli-Klone zeigen eine Bande be ca 180 kDa. Das Molekulargewicht von mRFP beträgt ca 30 kDa (CAMPBELL et al., 2002).
Die Bande bei ca 180 kDa entspricht demnach wahrscheinlich dem Fusionsprotein P01_orf1033 mit mRFP.
Abb. 3.5.3: Western-Blot von drei der erhaltenen fluoreszierenden E. coli-Klone.
Spur1: M. pneumoniae-Extrakt; Spur 2: Ein negativer Klon, Spur 3 -5: Drei fluoreszenz-positive Klone.
kDa 200 150 120
1 2 3 4 5
3.5.4 Sequenzierung der Fusionsstelle P01_orf1033 mit mRFP
Es wurde ein Oligonukleotid ausgewählt, welches 192 Basenpaare entfernt von der Fusionsstelle P01_orf1033 mit mRFP im Gen für mRFP an den codierenden Strang bindet. Die Sequenzierung erfolgte demnach von der Bindestelle des Oligonukleotides aus in Richtung der Fusionsstelle P01_orf1033 / mRFP und über diese hinaus. Die erhaltene Sequenz entsprach demnach dem nichtcodogenen Strang. Der codogene Strang wurde davon abgeleitet. Die Sequenz wurde geprüft, sie ist auszugsweise im folgenden dargestellt:
Die Basensequenz ist in 5’ nach 3’ –Richtung dargestellt. Die Sequenz beginnt innerhalb des P01_orf 1033 und geht über die Fusionsstelle bis in das Gen für mRFP.
Das 3’-Ende von P01_orf1033 und das 5’-Ende von mRFP sind gekennzeichnet. Im Bereich des Überganges von P01_orf1033 nach mRPF ist zusätzlich zur Basensequenz die Aminosäuresequenz angegeben.
3.5.5 Zusammenfassung der Klonierung von P01_orf1033
P01_orf1033 wurde so in den Vektor pKVmRFP kloniert, daß sich das Gen für mRFP ohne Unterbrechung des Leserasters am 3’-Ende von P01_orf1033 anschließt.
Folgende Skizze verdeutlicht die Lage von P01_orf1033 im Transposon Tn 4001 im Vektor pKV mit den vorhandenen Schnittstellen für die entsprechenden Restriktionsenzyme (siehe auch Kap. 2.2).
mRFP
EcoRI ApaI
P01_orf1033
BamHI BamHI
pKV
Tn 4001