3 Ergebnisse
3.3 Gen-Funktionsanalysen
3.3.1 Kandidatengene aus den Macroarray-Analysen
Fünf Gene aus der untersuchten GAN-cDNA Bank aus BTH-induzierten Epidermiszellen wurden als BTH-induziert bestätigt. Vor der Untersuchung des Einflusses der Gene auf die Mehltau-Resistenz wurden sie hinsichtlich ihrer Expression in der Epidermis überprüft.
Durch two step RT-PCRs konnte für alle fünf Gene die epidermale Expression gezeigt werden (ohne Abbildungen). Um ihre Funktion im Pathosystem Gerste/Bgh zu überprüfen, wurden die Translation der entsprechenden Gene durch RNA Interferenz ausgeschaltet.
3.3.1.1 Funktionelle Charakterisierung einer Cysteinprotease -GAN003J15-
Die Cysteinprotease GAN003J15 zeigt die höchste Homologie (2e-17 nach dem BlastX Algorithmus, ALTSCHUL et al., 1997) zu einer fruit bromelain Vorstufe aus Ananas (T10518). SAG12, eine Cysteinprotease aus A. thaliana wird im Zusammenhang mit dem Katabolismus und der Nährstoffmobilisierung während der Seneszenz diskutiert (LOHMAN
et al., 1994, NOH und AMASINO, 1999).
Der Einfluss des Ausschaltens der Cysteinprotease auf die Interaktion von IngridWt mit dem Echten Gerstenmehltaupilz wurde mikroskopisch ausgewertet (Abb. 3.6). In drei Ex-perimenten wurden Primärblätter von unbehandelten Pflanzen verwendet, und in drei wei-teren unabhängigen Experimenten wurden Primärblätter von Pflanzen verwendet, die 48 Stunden vor dem Partikelbombardement mit 60 ppm BTH behandelt wurden. Die Penetra-tionsrate errechnet sich als Verhältnis der transformierten Zellen mit Haustorien durch die Anzahl aller attackierten Gfp-Zellen. Die Abbildung 3.6 zeigt die Ergebnisse der transien-ten Transformation.
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ERGEBNISSE
RNAi Cysteinprotease
-GAN003J15-0,31
-0,15
0,07 0,08
-0,39
1,72
-0,59
0,25
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
1 2 3 Ø 1 2 3 Ø
Abweichung der relativen PE von der jeweiligen Kontrolle
Bodenapplikation von 60 ppm BTH 48 h vor Bombardement unbehandelt
Abb. 3.6: Einfluss des knock downs einer Cysteinprotease auf die Resistenz in Gerste gegenüber Bgh. Die Epider-mis von unbehandelten (weiße Säulen) und BTH-behandelten (grau hinterlegte Säulen) Primärblättern (cv.
IngridWt) wurde mit doppelsträngiger RNA der Cysteinprotease bzw. von Tr als Kontrolle jeweils in Kotransformation mit dem Reportergen Gfp in pGY-1 beschossen. Dargestellt ist die Abweichung der relati-ven Penetrationseffizienz (PE) von derjenigen der jeweiligen Kontrolle. Die Penetrationseffizienz ergibt sich aus dem Verhältnis der ausgebildeten Haustorien zur Summe der Interaktionsstellen. Die Balken geben den Standardfehler an.
Für die drei Experimente mit unbehandelten Primärblättern wurden pro Variante zwischen 68 und 101 Interaktionen ausgewertet. Diese Experimente zeigten, dass das Ausschalten der Cysteinprotease keine eindeutigen Veränderungen der Penetrationseffizienz (PE) im Vergleich zur Kontrolle bewirkte. In zwei Experimenten wurde die PE durch das Aus-schalten um 31 % bzw. um 7 % erhöht, während in einem Experiment die PE im Vergleich zur Kontrolle um 15 % gesenkt wurde. Der knock down der Cysteinprotease ergab im Mittel eine nicht signifikant erhöhte Anfälligkeit von 8 %. Daraufhin wurden ebenfalls drei unabhängige Experimente mit BTH-behandelten Blättern durchgeführt, in denen 59 bis 86 Interaktionen pro Variante ausgewertet wurden. Hier waren die beobachteten Abweichun-gen der Penetrationsrate von der Kontrolle größer, und ergaben im Mittel eine um 25 %erhöhte Anfälligkeit, die aber verursacht durch schwankende Effekte nicht signifikant war. In zwei Experimenten wurde die PE durch den knock down um 39 % bzw. um 59 % gesenkt, während die in einem dritten Experiment um 172 % erhöht wurde.
55
ERGEBNISSE
3.3.1.2 Funktionelle Charakterisierung eines Reticulon-ähnlichen Gens -GAN001D12-
Die Reticulon-Proteine wurden zuerst in höheren Vertebraten beschrieben (VAN DE VELDE
et al., 1994). Es handelt sich um 200-1200 Aminosäuren große Proteine, die mit dem En-doplasmatischen Reticulon assoziiert sind.
Es wurden fünf unabhängige transiente Transformationen mit unbehandelten Primärblät-tern durchgeführt, bei denen zwischen 62 und 91 Interaktionen pro Variante ausgewertet wurden. Drei voneinander unabhängige Experimente wurden mit Primärblättern von Ingrid Wt-Pflanzen durchgeführt, die 48 Stunden vor dem Partikelbombardement mit 60 ppm BTH behandelt wurden. Hier wurden pro Variante zwischen 57 und 70 Interaktio-nen ausgewertet. Die Abbildung 3.7 zeigt die Ergebnisse der Versuche.
RNAi -Reticulon like,
GAN001D12-0,28
-0,18 0,40
0,03
0,12 0,13 0,43
-0,05
0,100,14
-0,3 -0,2 -0,1 - 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
1 2 3 4 5 Ø 1 2 3 Ø
Bodenapplikation von 60 ppm BTH 48 h vor Bombardement unbehandelt
Abweichung der relativen PE von der jeweiligen Kontrolle
Abb. 3.7: Einfluss des knock downs eines Reticulon-like Gens auf die Resistenz in Gerste gegenüber Bgh. Die Epidermis von unbehandelten (weiße Säulen) und BTH-behandelten (grau hinterlegte Säulen) Primärblättern (cv. IngridWt) wurde mit doppelsträngiger RNA eines Reticulon-like Gens bzw. von Tr als Kontrolle jeweils in Kotransformation mit dem Reportergen Gfp in pGY-1 beschossen. Dargestellt ist die Abweichung der re-lativen Penetrationseffizienz (PE) von derjenigen der jeweiligen Kontrolle. Die Penetrationseffizienz ergibt sich aus dem Verhältnis der ausgebildeten Haustorien zur Summe der Interaktionsstellen. Die Balken geben den Standardfehler an.
Die fünf Experimente mit unbehandelten Primärblättern zeigten teilweise recht starke Effekte. In vier der fünf Experimente bewirkte das Ausschalten des Reticulon-like Gens eine zwischen 3 und 40 % erhöhte Anfälligkeit. In einem Experiment wurde die Penetrati-onsrate des Pilzes allerdings um 18 % reduziert. Der Mittelwert gibt eine um 13 % erhöhte 56
ERGEBNISSE
PE im Vergleich zur Kontrolle, diese ist jedoch nicht signifikant. Ähnlich sind die Ergeb-nisse der Experimente, in denen Blätter von BTH-behandelten Pflanzen verwendet wurden.
In zwei Experimenten bewirkte der knock down des Gens eine erhöhte PE im Vergleich zur Kontrolle, während in einem Experiment eine 5 %ige Reduktion der Penetrationsrate er-zielt wurde. Im Mittel sind diese Änderungen ebenfalls nicht signifikant.
3.3.1.3 Funktionelle Charakterisierung von GAN001K12
GAN001K12 zeigte in den two step RT-PCRs sehr starke und frühe Induktion durch die Applikation von BTH. Das Gen zeigt Homologie zu einem EST in der TIGR-Datenbank, der bislang allerdings nicht funktional charakterisiert ist. In vier unabhängigen transienten Transformationsexperimenten mit Primärblättern von unbehandelten Pflanzen mit jeweils zwischen 62 und 105 ausgewerteten Interaktionen pro Variante und zwei unabhängigen Experimente mit Blättern von BTH-behandelten Blättern, bei denen 64 bis 70 Interaktio-nen pro Variante ausgewertet wurden, wurde ein möglicher Einfluss auf die Bgh-Resistenz überprüft. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Abbildung 3.8 dargestellt.
unbehandelt Bodenapplikation von 60 ppm BTH 48 h vor Bombardement
RNAi Gen
-GAN001K12-0,29
-0,39 -0,36 0,27
-0,36 2,09
0,87
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
1 2 3 4 Ø 1 2 Ø
Abweichung der relativen PE von der jeweiligen Kontrolle
Abb 3.8: Einfluss des knock downs des Gens GAN001K12 auf die Resistenz in Gerste gegenüber Bgh. Die Epidermis von unbehandelten (weiße Säulen) und BTH-behandelten (grau hinterlegte Säulen) Primärblättern (cv. IngridWt) wurde mit doppelsträngiger RNA des Gens GAN001K12 bzw. von Tr als Kontrolle jeweils in Kotransformation mit dem Reportergen Gfp in pGY-1 beschossen. Dargestellt ist die Abweichung der relati-ven Penetrationseffizienz (PE) von derjenigen der jeweiligen Kontrolle. Die Penetrationseffizienz ergibt sich aus dem Verhältnis der ausgebildeten Haustorien zur Summe der Interaktionsstellen. Die Balken geben den Standardfehler an.
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ERGEBNISSE
Das transiente Ausschalten dieses Gens, das keine Homologie zu bereits charakterisierten Genen zeigt, hat in unbehandelten keinen signifikanten Effekt auf die Penetrationsrate von Bgh. Die beiden Experimente mit BTH-behandelten Blättern zeigten Effekte in entgegen-gesetzte Richtungen, so dass hier keine abschließende Aussage möglich ist.
3.3.1.4 Funktionelle Charakterisierung von GAN001E14
Für das chemisch induzierbare Gen GAN001E14 konnte bislang kein sequenzhomologes Gen, dem eine Funktion zugewiesen werden konnte, identifiziert werden. Zur Überprüfung seiner Funktion in der Gerste/Bgh-Interaktion wurde das Gen durch RNA Interferenz tran-sient ausgeschaltet. Es wurden jeweils zwei Experimente mit unbehandelten bzw. mit BTH-behandelten Primärblättern durchgeführt. In den Experimenten wurden zwischen 54 und 123 Interaktionen pro Variante ausgewertet. Die Ergebnisse sind Abbildung 3.9 dargestellt.
RNAi -unbekanntes Gen,
GAN001E14--0,24 -0,25 -0,24
0,09
-0,09
0,00
-0,30 -0,25 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15
1 2 Ø 1 2 Ø
A
Bodenapplikation von 60 ppm BTH 48 h vor Bombardement bweichung der relativen PE von de jeweiligen KontrollerAbweichung der relativen PE von der jeweiligen Kontrolle
unbehandelt
Abb 3.9: Einfluss des knock downs des Gens GAN001E14 auf die Resistenz in Gerste gegenüber Bgh. Die Epidermis von unbehandelten (weiße Säulen) und BTH-behandelten (grau hinterlegte Säulen) Primärblättern (cv. IngridWt) wurde mit doppelsträngiger RNA des Gens GAN001E14 bzw. von Tr als Kontrolle jeweils in Kotransformation mit dem Reportergen Gfp in pGY-1 beschossen. Dargestellt ist die Abweichung der relati-ven Penetrationseffizienz (PE) von derjenigen der jeweiligen Kontrolle. Die Penetrationseffizienz ergibt sich aus dem Verhältnis der ausgebildeten Haustorien zur Summe der Interaktionsstellen. Die Balken geben den Standardfehler an.
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ERGEBNISSE
Das transiente Ausschalten dieses Gens mit unbekannter Funktion zeigte in zwei durchge-führten Experimenten eine Verringerung der Penetrationsrate um etwa 25 % in unbehan-delten Blättern, hatte jedoch keinen Effekt in BTH-behanunbehan-delten Blättern.
3.3.1.5 Funktionelle Charakterisierung von GAN001L11
GAN001L11, ein weiteres chemisch induzierbares Gen, das durch die Macroarray-Analy-sen identifiziert wurde, besitzt keine Homologien zu Genen, deren Funktion bekannt ist. Es wurde untersucht, ob das transiente Ausschalten dieses Gens durch RNA Interferenz einen Einfluss auf die Gerste/Bgh-Interaktion hat. Dazu wurden zwei Versuche mit unbehandel-ten Primärblättern und drei mit BTH-behandelunbehandel-ten Primärblättern des Kultivars IngridWt durchgeführt. Pro Experiment und Variante wurden zwischen 51 und 123 Interaktionen ausgewertet. Abbildung 3.10 zeigt die Ergebnisse der Versuche.
RNAi -unbekanntes Gen,
GAN001L11-0,10
-0,09
0,00 0,02
0,44
-0,44
0,00
-0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
1 2 Ø 1 2 3 Ø
Abweichung der relativen PE von der jeweiligen Kontrolle
Bodenapplikation von 60 ppm BTH 48 h vor Bombardement unbehandelt
Abb 3.10: Einfluss des knock downs des Gens GAN001L11 auf die Resistenz in Gerste gegenüber Bgh. Die Epidermis von unbehandelten (weiße Säulen) und BTH-behandelten (grau hinterlegte Säulen) Primärblättern (cv. IngridWt) wurde mit doppelsträngiger RNA des Gens GAN001L11 bzw. von Tr als Kontrolle jeweils in Kotransformation mit dem Reportergen Gfp in pGY-1 beschossen. Dargestellt ist die Abweichung der relati-ven Penetrationseffizienz (PE) von derjenigen der jeweiligen Kontrolle. Die Penetrationseffizienz ergibt sich aus dem Verhältnis der ausgebildeten Haustorien zur Summe der Interaktionsstellen. Die Balken geben den Standardfehler an.
Das Ausschalten des Gens GAN001L11 zeigt in unbehandelten Blättern in beiden Versu-chen nur sehr schwache Effekte auf die Interaktion mit Bgh. In Blättern, die 48 Stunden vor dem Beschuss mit BTH behandelt wurden, sind keine bzw. mit jeweils 44 % Effekte sowohl in Richtung Anfälligkeit als auch zu erhöhter Resistenz beobachtet worden. Mittelt 59
ERGEBNISSE
man jeweils die Ergebnisse der einzelnen Versuche, hat der knock down des Gens keinen Effekt auf die Resistenzausprägung der Gerste gegenüber Bgh.