Abb.3 Zeitlicher Verlauf des durchschnittlichen Körpergewichts der verschiedenen Behandlungsgruppen während der Substanzapplikation an den einzelnen Behandlungstagen
Mittelwerte, n=12/Gruppe, * p<0,05 versus Kontrolle Aus Gründen der Übersichtlichkeit keine Abbildung der SEM
Gewichtsänderung (g) KO E2 0.6 4MBC 10 4MBC 33 4MBC 100 4MBC 333 4MBC 1000
Abb.4 Gewichtsänderung des Körpergewichts der verschiedenen Behandlungsgruppen vom 1. auf den 5.Behandlungstag in Gramm
Mittelwerte und SEM, n=12/Gruppe, * p<0,05 versus Kontrolle
Zu Beginn der Behandlung wog jedes Tier durchschnittlich 315,1g. Im Verlauf der Behandlung nahmen die Tiere der Kontrollgruppe um durchschnittlich 5,8g zu. Hingegen war bei allen anderen Behandlungsgruppen eine Gewichtsabnahme zu verzeichnen. Die stärkste Gewichtsreduktion wurde bei den mit 1000mg/kg KG behandelten Tieren ausgelöst; in den fünf Behandlungstagen sank das durchschnittliche Gewicht um 26,7g, was 8,6% des
Ausgangsgewichts entsprach. Eine signifikante Abnahme dieser Gruppe konnte ab dem fünften Behandlungstag verzeichnet werden. Die Abnahme in der Östradiol-Gruppe betrug 20,5g. Bei den Tieren der anderen 4-MBC-Gruppen war der Gewichtsverlust nicht so stark ausgeprägt. Am geringsten fiel er mit 1,2 g bei 4-MBC 10 aus, während er bei 4-MBC 333 immerhin noch 8,6g betrug. Eine signifikante Änderung des Körpergewichts vom ersten auf den fünften Behandlungstag als Vergleich der verschiedenen Behandlungsgruppen zur Kontrolle wurde sowohl durch Behandlung mit Östradiol als auch mit 4-MBC 1000
Abb.5 Absolute (links) und relative (rechts) Uterusgewichte der verschiedenen Behandlungsgruppen nach Substanzapplikation in Milligramm bzw. in Prozent des Körpergewichts
Mittelwerte und SEM, n=12/Gruppe, * p<0,05 versus Kontrolle
Eine signifikante Erhöhung des Uterusfeuchtgewichts im Vergleich zur Kontrollgruppe war sowohl in der Östradiol-Gruppe als auch in den höheren 4-MBC-Dosen, 333 und 1000mg/kg KG, zu sehen. Im Durchschnitt wogen die Uteri der Kontrollgruppe 104mg. Die mit Östradiol behandelten Tiere zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe ein um den Faktor drei erhöhtes Uterusgewicht (325,5mg). Das durchschnittliche Uterusgewicht der Gruppen 4-MBC 333 und 4-MBC 1000 betrug 152,5mg bzw. 157,8mg, was einer Zunahme um den Faktor 1,46 bzw.
1,52 entspricht. Insgesamt stieg unter der Behandlung mit 4-MBC das Uterusgewicht dosisabhängig an. Auch bei der Relativierung des Uterusgewichts auf das Körpergewicht konnte beobachtet werden, dass die Behandlungen mit Östradiol und den beiden höchsten Dosen 4-MBC eine signifikante Erniedrigung des Körpergewichts zur Folge hatte.
3.3.2 ERα-Genexpression
Die uterine Genexpression von ERα wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe durch Östradiol leicht gehemmt, wobei hier aufgrund Streuung der Messwerte keine signifikanten Unterschiede zur Kontrollgruppe gefunden werden konnten. Zusammenfassend zeigten sich keine Effekte von 4-MBC auf die ERα-Transkriptmenge des Uterus.
KO E2 0
.6 4MB
C 10 4MB
C 33 4MB
C 10 0
4MB C 33
3
4MB C 10
00 0
25 50 75 100 125
% der Kontrolle
Abb.6 Uterine ERα-Genexpression der verschiedenen Behandlungsgruppen in Prozent der Kontrolle Mittelwerte und SEM, n=12 / Gruppe
3.3.3 ERβ-Genexpression
Alle Behandlungen waren in der Lage, die uterine ERβ-Expression signifikant zu unterdrücken, wobei Östradiol der stärkste Suppressor war. Die geringste Wirkung auf die Abnahme der Genexpression hatte die niedrigste 4-MBC-Dosis (10mg/kg KG). Von den mit 4-MBC behandelten Tieren führte 4-MBC in der 333mg/kg KG Dosierung zur stärksten Reduktion der ERβ-Transkriptmenge, gefolgt von den anderen Dosierungen in der Reihenfolge 1000 > 33 > 100mg/kg KG.
KO
Abb.7 Uterine ERβ-Genexpression der verschiedenen Behandlungsgruppen in Prozent der Kontrolle Mittelwerte und SEM, n=12 / Gruppe, * p<0,05 versus Kontrolle
3.3.4 IGF1-Genexpression
Die Genexpression von IGF1 im Uterus wurde am stärksten und signifikant durch die höchste 4-MBC-Dosis stimuliert. Eine starke, wenn auch nicht signifikante Zunahme der Transkriptmenge wurde auch unter der Behandlung mit Östradiol und 4-MBC 333 beobachtet. Bei den drei niedrigeren 4-MBC-Dosierungen zeigte sich keine Wirkung auf die uterine IGF1-Expression.
KO E2 0.6
4MB C 10
4MB C 33
4MB C 10
0
4MB C 33
3
4MB C 10
00 0
250 500
750
*
% der Kontrolle
Abb.8 IGF1-Genexpression des Uterus der verschiedenen Behandlungsgruppen in Prozent der Kontrolle Mittelwerte und SEM, n=12/Gruppe, * p<0,05 versus Kontrolle
3.3.5 C3-Genexpression
Eine starke Zunahme der uterinen C3-Transkription erfolgte zum einen unter der Behandlung mit Östradiol, zum anderen in den beiden höheren 4-MBC-Dosierungen, 333 und 1000mg/kg KG. Dabei waren nur die Stimulation der C3-Expression durch Östradiol und die MBC-Höchstdosis signifikant. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten die drei niedrigeren 4-MBC-Dosierungen minimal erhöhte Transkriptmengen von C3.
KO
Abb.9 Uterine C3-Genexpression der verschiedenen Behandlungsgruppen in Prozent der Kontrolle Mittelwerte und SEM, n=12 / Gruppe, * p<0,05 versus Kontrolle
3.4 Vagina
3.4.1 Vaginalzytologie
Der zytologische Vaginalbefund der Kontrolltiere zeigte ein überwiegend aus Leukozyten bestehendes Zellbild entsprechend einem späten Diöstrus mit vereinzelten mittelgroßen, zellkernhaltigen Epithelzellen. Hingegen wurde durch die Behandlung mit Östradiol ein östrusartiger Befund mit sehr großen zellkernlosen, verhornten Epithelzellen hervorgerufen.
In den Behandlungsguppen 4-MBC 10, 33 und 100 fanden sich diöstrusartige Vaginalzytologien. Bei den mit 333 und 1000mg/kg KG behandelten Tieren fanden sich große polygonale Epithelzellen wie durch die Östrogeneinwirkung im Östrus.
A B
C D
E F
G
Abb.10 Repräsentative Vaginalzytologiender verschiedenen Behandlungsgruppen in 20facher Vergrößerung
(Giemsafärbung)
A: KO B: E2 0,6 C: 4-MBC 10 D: 4-MBC 33 E: 4-MBC 100 F: 4-MBC 333 G: 4-MBC 1000
100 µm
3.4.2 Cornifin-Genexpression
Die vaginale Genexpression von Cornifin wurde im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikant durch Östradiol stimuliert. Unter jeder Behandlung mit 4-MBC kam es, wenn auch nicht signifikant, zu einer Zunahme der Cornifin-Transkription. Die stärkste stimulierende Wirkung wurde dabei von 4-MBC 1000mg/kg KG erzielt, gefolgt von 4-MBC 333mg/kg KG.
Die drei niedrigeren 4-MBC-Dosierungen zeigten eine weniger deutliche Zunahme der Genexpression, wobei die Gruppen 4-MBC 10 und 33 eine ähnliche Wirkung hatten. Im Vergleich zu diesen Gruppen kam es in der 100mg/kg KG Gruppe zu einer leichten Abnahme der Transkriptmenge.
KO
E2 0.6 4MB
C 10 4MB
C 33 4MB
C 10 0
4MB C 33
3
4MB C 10
00 10
100 1000
10000
*
% der Kontrolle (log 10)
Abb.11 Vaginale Genexpression von Cornifin der verschiedenen Behandlungsgruppenin Prozent der Kontrolle, Mittelwerte und SEM, n=12 / Gruppe, * p<0,05 versus Kontrolle
3.5 Leber
3.5.1 IGF1-Genexpression
Unter der Behandlung mit Östradiol kam es zu einer signifikanten Abnahme der IGF1-Transkription in der Leber. Auch die beiden höheren 4-MBC-Dosierungen waren in der Lage, diese Genexpression signifikant zu verringern. Insgesamt zeigte sich eine dosisabhängige Reduktion der IGF1-Expression durch 4-MBC.
KO
E2 0.6 4MB
C 10 4MB
C 33 4MB
C 10 0
4MB C 33
3
4MB C 10
00 0
25 50 75 100 125
* *
*
% der Kontrolle
Abb.12 Hepatische IGF1-Genexpression der verschiedenen Behandlungsgruppenin Prozent der Kontrolle Mittelwerte und SEM, n=12 / Gruppe, * p<0,05 versus Kontrolle