RNA-Isolierung

Plasma und Aszites wurden bis zur Untersuchung bei - 20 °C eingefroren. Das EDTA-Vollblut wurde gleich nach Erhalt aufbereitet.

3.2.1.1 RNA - Isolierung aus Plasma und Aszites

RNA aus Plasma oder Ascites wurde mit dem "QIAmp Viral RNA Kit" (QIAGEN, Deutschland) nach Angaben des Herstellers isoliert. Das Prinzip beruhte auf einer Bindung der Nukleinsäure an eine Silica-Gel-geladenen Membran. Zuerst wird die Probe lysiert und RNAsen dabei denaturiert. Dann bindet die Nukleinsäure an der Membran, während Kontaminanten wie Proteine und Nukleasen herausgewaschen werden. Schließlich erfolgt die Elution der gebundenen Nukleinsäure. Da dieser Kit nicht DNA von RNA separieren kann, mußte eine Kontamination durch DNA vermieden werden. Dazu wurden die Proben 10 Minuten bei 1500 x g mit einer Tischzentrifuge (Biofuge fresco, Heraeus instruments) zentrifugiert, um einen zellfreie Flüssigkeit zu erhalten. Von dem zellfreien Überstand wurden dann140 µl benötigt.

Ausser den Reagenzien, die im Kit enthalten sind, wurden Ethanol (96-100 %ig) (Roth, Deutschland), Eppendorf-Caps (1,5ml), sterile, RNase-freie Pipettenspitzen und Handschuhe benötigt. Zur Vorbreitung mußte der AVL-Puffer (Viruslysepuffer) aus dem Kit mit der beigefügten Träger-RNA vermischt werden. Der AVL-Puffer ist zur Lysis der Viren und Denaturierung von RNasen nötig. Der im Kit enthaltene AW-Puffer (Waschpuffer) wurde mit dem 96-100 %-igen Ethanol versetzt. Mit ihm wurde die an die Membran gebundene RNA gewaschen und von Kontaminanten gereinigt.

140µl der auf Raumtemperatur gebrachten Probe wurden in ein 1,5 ml Eppendorf-Cap

gegeben. 560µl des mit der Träger-RNA präparierten AVL-Puffers wurden hinzugefügt und gemischt (Vortex-Genie 2, Scientific Industries, USA), um eine homogene Lösung zu erhalten. Für eine vollständige Lysis der Viruskapsel und, um einen möglichst hohen Ertrag an RNA zu erhalten, wurde diese Mixtur 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 560µl 96-100 %-igen Ethanols wurden in die Probe gegeben und vermischt. Dadurch werden die Bindungseigenschaften verbessert und der RNA Ertrag erhöht. Die QIAmp spin- Säule wurde in ein 2 ml Sammelröhrchen gestellt, und 630µl der vorher beschriebenen inkubierten Mixtur wurden dort hineinpipettiert. Danach wurde für 1 Minute bei 6000 x g mit der Tischzentrifuge Biofuge fresco (Heraeus instruments) zentrifugiert, damit die RNA an der Membran gebunden werden kann. Die QIAmp spin-Säule mit der gebundenen RNA wurde in ein neues 2 ml Sammelröhrchen gestellt und das alte mit dem Durchfluß verworfen. Der Rest der vorher beschriebenen inkubierten Mixtur wurden auf die QIAmp spin-Säule pipettiert und noch einmal bei 6000 x g zentrifugiert. Es wurden immer neue Sammelröhrchen benutzt, um mögliche Kontaminationen zu vermeiden. Der Filter wurde wieder in ein neues 2 ml Sammelröhrchen gestellt und 500µl des AW-Puffers aus dem Kit hinzugegeben. Es folgte wieder eine Zentrifugation für 1 Minute bei 20000 x g. Durch diese Zentrifugation bei höchster Geschwindikeit sollten alle Spuren des AW-Puffers vor der Elution entfernt werden.

Durchfluß und Sammelröhrchen wurden verworfen und der Filter in ein 1,5 ml Eppendorf-Cap gestellt. Die anschließende Elution der RNA erfolgte mit 50µl RNase-freiem Wasser, das auf 80°C erhitzt wurde, um eine bessere Elution zu ermöglichen und den RNA Ertrag zu erhöhen. Abschließend wurde 1 Minute bei 6000 x g zentrifugiert. Die so gewonnene RNA konnte direkt in der Reversen-Transkriptase-Reaktion eingesetzt werden.

3.2.1.2 RNA-Isolierung aus Vollblut

Die RNA-Isolierung aus EDTA-Vollblut fand mit Hilfe des "QIAmp Blood Kit" von QIAGEN, Deutschland, nach Angaben des Herstellers statt.

Außer den im Kit enthaltenen Reagenzien wurden noch 96-100 %-iges Ethanol (Roth, Deutschland), 70 %-iges Ethanol (96-100 %-iges Ethanol mit RNase-freiem Wasser versetzt),

14,5 M β-Mercaptoethanol (SIGMA, Deutschland), 1,5-15 ml Röhrchen zur Erythrozytenlyse, sterile, RNase-freie Pipettenspitzen und Handschuhe benötigt.

Vor dem Beginn wurde der RPE-Puffer aus dem Kit mit 4 Volumeneinheiten 96-100 %igem Ethanol vermischt. RPE-Puffer ist zur Reinigung der an die membrangebundenen RNA von Kontaminanten. Der im Kit vorhandene RLT-Puffer wurde, wenn Präzipitate vorhanden waren, erst erwärmt, um diese zu lösen. RLT-Puffer ist zur Zerstörung der Leukozytenzellen notwendig. Außerdem mußte vor Gebrauch β-Mercaptoethanol hinzugefügt werden (10 µl auf 1 ml Puffer). β-Mercaptoethanol verhindert die Bildung von Disulfidbrücken zwischen Thiolgruppen, die durch Denaturierung von Proteinketten (Leukozytenlysis) zugänglich geworden sind. RLT-Puffer war nach Zugabe des β-Mercaptoethanols einen Monat haltbar.

Nach der Erythrozytenlyse durch den im Kit vorhandenen EL-Puffer wurden alle Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt. Leukozytenpellets (s.u.) oder Zellysat in RLT-Puffer konnten bei -70° C aufbewahrt werden. Zur weiteren Verarbeitung mußte das Zellysat bei 37° C für 10 Minuten inkubiert werden, um sicher zu gehen, dass alle Salze aufgelöst waren.

Für die RNA Isolierung wurden 1 ml EDTA-Vollblut benötigt. Das Vollblut wurde mit 5 ml EL-Puffer aus dem Kit versetzt. Diese Mischung wurde 10-15 Minuten auf Eis inkubiert.

Durch die Zugabe dieses speziellen hypotonischen Puffers wurden die Erythrozyten selektiv lysiert. Die Leukozyten wurden bei diesem Verfahren nicht geschädigt und wurden durch 10-minütige Zentrifugation (Medifuge, Heraeus Sepatech) bei 400 x g pelletiert. Der Überstand wurde vollständig verworfen. Um restliche Spuren noch vorhandener Erythrozyten zu beseitigen, die dem Pellet einen rötlichen Farbton gaben, wurde folgender Waschschritt angeschlossen: Es wurden nochmals 2 ml EL-Puffer hinzugegeben und gut mit dem Pellet vermischt und bei 400 x g 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder vollständig verworfen. Zu dem daraus entstandenen Leukozytenpellet wurden 600 µl des mit β-Mercaptoethanol versetzten RLT-Puffers hinzugegeben und durch Auf- und Abpipettieren vermischt. Dadurch wurden die Leukozyten lysiert und RNasen inaktiviert. Das Leukozytenlysat wurde auf einen QIAshredder aus dem Kit pipettiert, der in einem 2 ml Sammelröhrchen saß. Dieses wurde 2 min bei 20000 x g mit der Tischzentrifuge zentrifugiert, wobei das Leukozytenlysat homogenisiert wurde. 600 µl 70%iges Ethanol wurde hinzugegeben, um die Bindungseigenschaften zu unterstützen: die vorhandenen

Nukleinsäuren binden an eine Silica-Gel-Membran in einer Rneasy mini spin-Säule aus dem Kit. Die Probe wurde auf diese Membran pipettiert und bei 15 sec bei > 8000 x g zentrifugiert.

Nach Entfernung von Kontaminanten wie Proteinen und Nukleasen durch Zugabe von 700 µl RW1-Puffer aus dem Kit und Zentrifugation für 15 sec bei < 8000 x g wurde die Membran in ein neues 2 ml Sammelröhrchen gestellt. Dann wurden 500 µl RPE-Puffer aus dem Kit hinzupipettiert und für 15 sec bei < 8000 x g zentrifugiert. Dies ist ein weiterer Waschvorgang um Kontaminanten zu entfernen. Der Durchfluß wurde verworfen und nochmal 500 µl RPE-Puffer hinzugefügt. Dann wurde 2 Minuten bei > 8000 x g zentrifugiert. Diese Zentrifugation ist notwendig, um alle Spuren von Ethanol zu entfernen. Die RNA wurde nach Zugabe von 30µl RNAse-freiem Wasser und 1 min Zentrifugation bei > 8000 x g eluiert. Das Eluat wurde nochmals auf die Membran gegeben und zentrifugiert. Um einen möglichst hohen RNA Ertrag zu erhalten, wurde diese zweite Elution vorgenommen. Die gewonnene RNA konnte dann direkt in der RT-Reaktion verwendet werden. Die kleinen Mengen vorhandener DNA stören in den folgenden Reaktionen nicht, weil diese spezifisch die RNA transkribieren und amplifizieren.