Isolierung von CD34 + hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut

Prinzip:

Magnetpartikel gekoppelte Antikörper binden an ihr komplementäres Antigen und halten die so markierten Zellen im Magnetfeld gefangen, während nicht markierte Zellen das Magnetfeld passieren. Auf diese Weise isolierte Zellen können durch Eluieren gewonnen und weiterverarbeitet werden (Kultivierung, FACS-Färbung usw.).

Reagenzien:

Waschpuffer: PBS

EDTA 2 mmol/l

BSA 0,5%

Lymphoprep^TM (RT)

MACS Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit: monoklonal Maus anti-human CD34 (Maus IgG1, Klon QBEND/10)

Durchführung:

Durch 2 M EDTA antikoaguliertes Nabelschnurblut wurde 1:4 bis 1:5 mit Waschpuffer verdünnt, gut durchmischt, jeweils 25 ml auf 15 ml Lymphoprep^TM (siehe auch 2.2.1.2.) in 50-ml-Röhrchen vorsichtig aufgeschichtet und für 20 min bei 400 g und RT ohne Bremse zentrifugiert. Danach wurde der Großteil des gelblichen Überstandes abgesaugt und die daran angrenzende Interphase in neuen 50-ml-Röhrchen gepoolt und mit Waschpuffer gewaschen (10 min bei 200 g und RT ohne Bremse). Nach Vereinigen der Pellets wurde abermals zentrifugiert für 5 min bei 200 g bei RT mit Bremse, der Überstand verworfen, das Pellet in 5 ml Erythrozytenlysispuffer aufgenommen und für 5 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Röhrchen bis 50 ml mit Waschpuffer aufgefüllt und wieder für 5 min bei 200 g und RT mit Bremse zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes erfolgte das Resuspendieren

Material und Methoden des Pellets in 300 µl Waschpuffer/10⁸ Zellen. Durch Zugabe von 100 µl Fc-Blocking-Reagenz/10⁸ Zellen und Inkubation auf Eis für 20 min sollten die Fc-Rezeptoren der Zellen abgesättigt werden, um unspezifische Bindungen mit den Anti-CD34-Antikörpern zu vermeiden. Während der Inkubationszeit wurde die Zellsuspension ab und zu vorsichtig geschwenkt, um eine gleichmäßige Verteilung der Blockantikörper zu gewährleisten.

Anschließend erfolgte die Zugabe von 100 µl CD34-Microbeadlösung/10⁸ Zellen. Nach einer 30 minütige Inkubation bei 4°C unter ständigem Durchmischen wurden die Zellen vorsichtig zweimal mit Puffer gewaschen, in 1000 µl Puffer aufgenommen und auf eine MS-Säule, die im Magnetfeld des MACS-Separators platziert war, pipettiert. Die Säule wurde vollständig mit Puffer durchgespült und danach mit der Zellsuspension versehen. Nachdem die Suspension die Säule passiert hat und diese drei Mal mit Puffer gespült wurde, konnte sie aus dem Magnetfeld entfernt und in einem geeigneten Auffangröhrchen platziert werden. Nun erfolgte die Zugabe einer ausreichenden Menge Waschpuffer und mit dem zur Säule gehörenden Stempel drückte man die Zellen aus der Säule heraus. Der Vorgang wurde wiederholt, um sicherzugehen, dass alle in der Säule vorhandenen Zellen ausgewaschen wurden. Nach der Bestimmung der Anzahl der eluierten Zellen, wurden diese durch Zentrifugation pellettiert, anschließend in einer entsprechenden Menge IMDM-Medium (2 bis 3 x 10⁵ Zellen/ml) inklusive der Cytokine Flt3-Ligand (25 ng/ml), TPO (10 ng/ml) und SCF (20 ng/ml) aufgenommen und auf eine 6-Well-Platte überführt (5 x 10⁵ Zellen/ml, 2 ml/Well).

Alle Arbeitsschritte sind so zügig wie möglich durchzuführen. Erscheint die Zellsuspension klumpig oder treten sichtbare Gerinsel auf, so ist die Suspension durch ein vorher angefeuchtetes Sieb oder Nylonnetz zu geben, um ein Verstopfen der Separationssäule zu vermeiden.

Die Dauer der Kultivierung der hämatopoetischen Vorläuferzellen erfolgte in Abhängigkeit ihres Proliferationsverhaltens über einen Zeitraum von vier bis sechs Wochen. Danach wurden die suspendierten Zellen geerntet, gezählt und 1x10⁷/ml in CB-Kryomedium in flüssigem Stickstoff bis zur weiteren Verwendung eingefroren oder die Zellen unter Wechsel der Cytokine vom Proliferationscocktail zu GM-CSF mit und ohne IL-4 für zwei Wochen weiterkultiviert. Anteilig wurden GM-CSF/IL-4 Zellen zwei Tage vor der Ernte mit 250 ng/ml LPS stimuliert und somit innerhalb von 48 h zur Ausreifung gebracht. Zweck der LPS Stimulation war es, zu überprüfen, ob die Zugabe eines Reifungsmediators zur Ausbildung DC-spezifischer Oberflächenantigene führt.

Material und Methoden

Abb. 7: CD34-Expression bei hämatopoetischen Zellen. Die pluripotenten Stammzellen sind in ihrer Entwicklung noch nicht festgelegt und können sich durch die Einwirkung spezifischer Mediatoren in verschiedene Richtungen entwickeln. Dieser Vorgang kann in vitro durch die Zugabe eines Cytokincocktails induziert werden. Je nach Art des Cocktails lassen sich Zellen verschiedener Populationen generieren. Die CD34⁺ Zellen mit bereits festgelegter Entwicklungsrichtung können in vitro in Abhängigkeit ihrer Reihenzugehörigkeit überleben oder sie werden aufgrund fehlender Entwicklungs- und Differenzierungssignale apoptotisch. Auf diese Weise erhält man nach Ablauf der Kultivierung eine hohe Reinheit an gewünschten Zellen (Produktinformation MILTENYI BIOTEC MACS).

2.2.1.2. Leukaphereseaufarbeitung

Prinzip:

Die Leukapherese oder Leukopherese ist eine Methode zur Auftrennung von Spenderblut.

Hierbei gewinnt man ein Leukozytenkonzentrat. Andere Blutbestandteile, wie Plasma und Erythrozyten, werden dem Spender größtenteils zurückgegeben. Die Aufarbeitung des Leukozytenkonzentrates mittels einer Dichtegradientenzentrifugation über Lymphoprep^TM (5,6%w/v) erlaubt die Gewinnung von peripheren blutmononukleären Leukozyten (PBMNL).

Lymphoprep ist ficollhaltig. Ficoll selbst ist eine kolloidale Lösung aus Methylcellulose.

Diese gewährleistet die Aggregation der noch enthaltenen Erythrozyten. Die Oberflächen der roten Blutzellen sind stark negativ geladen und stoßen sich gegenseitig ab. Diese physiologisch notwendigen Abstoßungskräfte werden vom Ficoll herabgesezt. Somit wird die Sedimentation der Erythrozyten erleichtert. In Lymphoprep^TM befindet sich außer Ficoll auch Natriummetrizoat (9,6%w/v). Diese Verbindung mit hoher Dichte gestattet die Auftrennung der einzelnen Zellarten in Abhängigkeit ihrer jeweiligen spezifischen Dichte.

Material und Methoden Reagenzien:

Lymphoprep^TM (RT) PBS

Durchführung:

Das Leukozytenkonzentrat wurde in eine sterile Flasche überführt, im Verhältnis 1:1 mit PBS (RT) vermischt und je 25 ml der Zellsuspension auf jeweils 15 ml Lymphoprep in 50-ml-Röhrchen vorsichtig aufgeschichtet. Nach der Zentrifugation (20 min bei RT und 1000 g ohne Bremse) wurde der Großteil des gelblichen Überstandes abgesaugt, die daran angrenzende Interphase (sie enthält die PBMNL) gesammelt und in auf Eis vorgekühlte 50-ml-Röhrchen überführt. Diese wurden mit kaltem PBS aufgefüllt und bei 4°C und 1000 g ohne Bremse für 10 min zentrifugiert. Danach konnten die Überstände abgesaugt, die Zellpellets in 5 bis 10 ml kaltem PBS resuspendiert, die Röhrchen aufgefüllt und anschließend bei 400 g und 4°C für 5 min mit Bremse zentrifugiert werden. Dieser Waschschritt wurde so oft wiederholt, bis die Überstände klar waren. Nach Beendigung des Waschvorganges erfolgte die Bestimmung der Gesamtzellzahl in einer Zählkammer nach Neubauer.

Zur Gewinnung von autologem Serum wurden die der Leukapherese beigegebenen Serummonovetten bei 1700 g und RT für 10 min ohne Bremse zentrifugiert, die Überstände (Serum) gesammelt und die Serummonovetten mit dem verbleibenden Blutkuchen verworfen.

2.2.1.3. Gewinnung von Monozyten durch Adhärenz und ihre Kultivierung