Interaktionspartner des pflanzlichen PBR-homologen Proteins

4.5.1 Two-Hybrid-Analyse

Das Hefe Two-Hybrid-System ist eine bedeutende in-vivo-Methode zum Identifizieren neuer Gene, die für Proteine kodieren, welche mit einem bekannten Protein interagieren.

Die Fähigkeit, beide, ein interagierendes Protein und das dafür kodierende Gen zu identifizieren, macht das Two-Hybrid-System zu einem wichtigen Werkzeug (Gietz et al., 1997). Es ist die erste genetische und molekulare Methode, die in vivo ausgeführt wird und damit das interagierende Protein in seiner wahrscheinlich nativen Konformation bestimmt.

Das Hefe Two-Hybrid-System und dabei das pflanzliche PBR-homologe Protein als „Bait“

(Köder) nutzend, wurden Interaktionen mit 3 verschiedenen Proteinen detektiert.

Die Anwendung des Two-Hybrid-Systems führte bisher zur Identifizierung ungezählter neuer interagierender Proteinpartner, ist aber dennoch begrenzt.

Sie kann nicht für alle Proteine angewandt werden. Einige erfordern Modifikationen wie Glykosilierungen, andere sind nur in spezifischen zellulären Kompartimenten und nicht im Zellkern aktiv (Gietz et al., 1997). Es können auch unerwartete Interaktionen bekannter Proteine festgestellt werden, die in vivo nicht auftreten (Chien et al., 1991), da sie dort in unterschiedlichen Kompartimenten lokalisiert sind. Falsch-positive Klone können diese Interaktion vortäuschen. Dieser Fall könnte bei Protein III vorliegen. Die im Two-Hybrid-System in Hefe gefundene Interaktionen sollten deshalb immer unter Nutzung einer weiteren Methode verifiziert werden. Mögliche Methoden sind z.B. Co-Immunopräzipitation, GST Fusion Protein Pull-Down Technique, Far Western with GST Fusion Proteins (Protokolle 2, 3 und 4 im Kapitel 18 von Sambrook et al., 2001) oder Enzymaktivitätstests.

Die GST Fusion Protein Pull-Down Technique ist keine absolut festgelegte Methode. Man kann unterschiedliche Modifizierungen vornehmen. Der durchgeführte GST-Pull-Down Assay wurde an die gegebenen Vorlagen angepaßt.

Es wurde eine Fraktionierungsmethode erstellt, die zu einer guten Trennung und Reinheit der Mitochondrienfraktion führte. Krueger und Papadopoulos (1990) beschrieben eine Methode, mit der Digitonin-solubilisierte Mitochondrienmembranen erhalten werden können. Im Tier ist der PBR an der Kontaktstelle zwischen der äußeren und der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert (Culty et al., 1999). Somit wurde davon ausgegangen, mittels Fraktionierungsmethode und Herstellung einer löslichen Mitochondrienfraktion, das pflanzliche PBR-homologe Protein für den Protein-Protein-Interaktionstest bereitzustellen.

Die mittels Two-Hybrid-Analyse detektierten Proteine I bzw. Ik, II und III wurden als GST-Fusionsproteine aufgereinigt. Anschließend daran konnte mit vergleichsweise experimentell geringem Aufwand das planzliche PBR-homologe Protein in Form der löslichen Mitochondrienpräparation auf die Glutathion-Sepharose-Säule gegeben werden.

Der Komplex der miteinander in Verbindung getretenen Proteine wurde eluiert, in einer SDS-Page aufgetrennt, und da ein Antikörper für das pflanzliche PBR-homologe Protein bereits früher hergestellt wurde, dieses damit detektiert.

Mittels dieses unkomplizierten GST-Pull-Down-Assays wurden die Interaktionen zwischem dem pflanzlichen PBR-homologen Protein und den Proteinen Ik und II bestätigt.

Protein I :

Die Sequenz von Protein I kodiert für ein putatives Membranprotein. An der Interaktion war das verkürzte Protein (Aminosäuren 125-212) beteiligt. Eine Methode zur Vorhersage von Transmembranbereichen (Hirokawa et al., 1998) gibt an, daß sich ein Transmembransegment außerhalb des Bereiches der Aminosäuren 125-212 befindet (Abb.

21). Der Teil des Proteines, der mit dem pflanzlichen PBR-homologen Protein interagierte (AS 125-212) enthält also keine unzugänglichen membrandurchspannenden Bereiche.

Eine Homologiesuche in einschlägigen Datenbanken, ausgehend vom Protein I, ergab Homologien zu einer emp24/gp25L/p24 Proteinfamilie. Die Mitglieder dieser Familie sind in den Transport von Proteinen weg vom ER eingebunden. Sie binden an die Coatomer-Proteine der sich abschnürenden Vesikel mit ihrer cytoplasmatischen Domäne. Sie sind an der Proteinselektion am ER sowie am intrazellularen Transport beteiligt (Dominguez et al., 1998). Das für die Bindung der Proteine notwendige Motiv K (X) K XX ist auch im Protein I aus A. thaliana vorhanden. Es befindet sich nicht innerhalb der Transmembrandomäne und liegt in dem Teil des Proteins, der im Two-Hybrid-Interaktionstest mit dem pflanzlichen PBR-homologen Protein reagiert hat. Man könnte somit eine Zuordnung des Proteins I zu den emp24/gp25L/p24 Proteinen, die am intrazellularen Transport beteiligt sind, vornehmen. Dies könnte auch ein Hinweis auf die Prozessierung des pflanzlichen PBR-homologen Proteins nach Transkription und Translation sein und auf bisher unbekannte Modifikationen des pflanzlichen PBR-homologen Proteins im ER hinweisen.

Protein II :

Die Sequenz von Protein II kodiert für ein unbekanntes Protein. Hier wurde die vollständige Sequenz in den Bibliotheksvektor kloniert.

Ausgehend von der Proteinsequenz II wurde eine Homologiesuche durchgeführt. Unter den ersten 20 Einträgen (Tab.9) befanden sich 12 Sequenzen für unbekannte, hypothetische oder putative Proteine. Unter den restlichen 8 gibt es 6 Sequenzen von NAM (no apical meristem) Proteinen bzw. NAC-like Proteinen, ein Mitglied der Familie der NAM Proteine (Acc.No. PF02365 Protein families database of alignments and HMMs Pfam). Die NAM Proteine gehören zur Proteinfamilie der Homeoboxproteine, das sind

Abbildung 21: Vorhersage des Transmembransegmentes (Methode nach Hirokawa et al., 1998) des Proteins I mit der Datenbankzugangsnummer Q9FVUO. Der Pfeil deutet auf das Motiv K (X) K XX, welches hier durch die Aminosäuren K (E) K IE gebildet wird.

DNA-bindende, regulatorische Proteine. Die verbleibenden zwei Proteine sind ein putatives DNA-bindendes Protein und eine rezeptorähnliche Proteinkinase.

Die Sequenz des Proteins II weist keine Konsensusmuster der NAM-oder NAC-like Proteine auf. Möglicherweise gehört das Protein II zu einer weiteren neuen Gruppe der NAM Proteine.

Tabelle 9: Die ersten 20 Einträge der Homologiesuche ausgehend vom Protein II (F3M18.4)

Acc.No. Beschreibung Ähnlichkeiten

Score (bits) E Value

At1g28520|F3M18.4 unknown protein 388 e-108

At2g42400|MHK10.12 hypothetical protein predicted... 32 1.3

At4g28500|F20O9.190 predicted protein CUC2… 31 2.2

At3g10010|T22K18.18 hypothetical protein similar… 31 2.2 At3g49530|T9C5.120 NAC2-like protein NAC2 – A.thal... 31 2.2 At2g23350|T20D16.2 putative poly(A) binding protein 31 2.2

At4g21430|F18E5.50 putative protein ... 31 2.8

At1g06510|F12K11.16 hypothetical protein … 31 2.8

At1g65910|F12P19.8 jasmonic acid, putative similar... 31 2.8 At1g77450|T5M16.4 GRAB1-like protein , a novel member of

the NAC domain family

31 2.8

At5g17260|MKP11.11 NAM (no apical meristem)-like protein 30 3.7 At1g74500|F1M20.18 putative DNA-binding protein... 30 3.7 At3g57830|T10K17.40 receptor-like protein kinase... 30 3.7

At5g15880|F1N13.20 putative protein 30 4.9

At1g33060|T9L6.13 NAC domain containing... 30 4.9

At2g07420|T13E11.19 putative retroelement pol protein... 30 4.9

At5g24590|K18P6.12 NAC2-like protein 29 6.4

At1g34180|F23M19.14 hypothetical protein… 29 6.4

At3g03200|T17B22.11 NAM-like protein (no apical... 29 6.4 At3g19060|K13E13.5 hypothetical protein predicted... 29 6.4

At1g25580|F2J7.1 unknown protein similar... 29 6.4

Eine weiter entfernte Homologie besteht zum PAP7 der Maus. Ein Alignment der 486 AS des Protein II mit den 445 AS des PAP7 der Maus ergab 53 identische AS und 175 ähnliche AS. Konservierte Bereiche sind nicht ersichtlich. Die vorhergesagten isoelektrischen Punkte befinden sich mit 5,73 für das Protein II und 5,48 für das PAP7 beide im sauren Bereich. Die Vorhersage für Sequenzmotive eines Proteins anhand der Aminosäurestrukur (Prosite) ergibt für beide Proteine (Protein II und PAP7):

◦ N-Glykosilierungsstellen,

◦ N-Myristilierungsstellen,

◦ Casein-Kinase II Phosphorylierungsstellen,

◦ Phosporylierungsstellen für PKA (cAMP-abhängige Proteinkinase Phosphorylierungsstelle).

Ausgehend von der Interaktion des Proteins II mit dem pflanzlichen PBR-homologen Protein und seinen Homologien zu einer Familie von regulatorischen Proteinen, sowie der entfernten Homologie zum PAP7 besteht die Möglichkeit, daß das Protein II ein regulatorisches Protein und Bestandteil eines Signaltransduktionsweges ist.

Protein III :

Die Sequenz von Protein III verschlüsselt eine putative Ribose-5-Phosphat-Isomerase. Es ist bekannt, daß die Ribose-5-Phosphat-Isomerase im Tier am Pentosephosphat-Cyclus beteiligt ist, der in Pflanzen jedoch in den Chloroplasten abläuft (Michal, 1999). Es ist mittels einschlägiger Programme keine eindeutige Vorhersage möglich, ob das detektierte Protein III in Chloroplasten oder Mitochondrien lokalisiert sein könnte. Eine Homologiesuche für die Sequenz von Protein III ergibt die höchsten Homologien zu Sequenzen von Ribose-5-Phosphat-Isomerasen (keine putativen) aus Bakterien. Es ist also nicht bekannt, welche Funktionen die putative Ribose-5-Phosphat-Isomerase in A. thaliana hat und wo sie lokalisiert ist.

Protein III hat wahrscheinlich im in vivo Bindungstest mit dem Two-Hybrid-System als falsch positiver Klon eine Interaktion vorgetäuscht. Diese konnte nicht im GST-Pull-Down-Assay bestätigt werden. Diese putative Ribose-5-Phosphat-Isomerase in A. thaliana könnte also in den Chloroplasten lokalisiert sein und somit in der natürlichen Umgebung nicht mit einem mitochondrialen pflanzlichen PBR-homologen Protein in Berührung kommen. Durch das Fehlen des Kompartimentes Chloroplast in der Hefe konnte es hier zu einer Bindung kommen, die in der Pflanze nicht möglich wäre. Die Lokalisation des pflanzlichen PBR-homologen Proteins konnte durch folgende Arbeiten gezeigt werden:

◦ Der GST-Pull-Down Assay wurde mit einer löslichen Mitochondrienfraktion durchgeführt. Es konnte jeweils eine Interaktion des pflanzlichen PBR-homologen Proteins aus der löslichen Mitochondrienfraktion gezeigt werden. Weiterhin konnte das pflanzliche PBR-homologe Protein in einer reinen Mitochondrienpräparation mittels Antikörper detektiert werden (Abb. 18).

◦ Die Aufnahme- und Bindungsstudien wurden mit isolierten Mitochondrien durchgeführt. Diese funktionellen Untersuchungen erbrachten Ergebnisse für ein pflanzliches PBR-homologes Protein in Mitochondrien.

◦ Durch einen Two-Hybrid-Interaktionstest wurde eine Interaktion der PPOX II mit dem pflanzlichen PBR-homologen Protein aus A. thaliana gezeigt (mündliche Mitteilung B.

Grimm). Translokalisierungsstudien und immunologische Analysen bewiesen einen Transport der PPOX II in die Mitochondrien von Nicotiana tabacum (Lermontova et al., 1997).

◦ Photoaffinitätsmarkierungen von Mitochondrien mit [³H]Flunitrazepam detektierten ein 30 kDa Protein und etwas schwächer ein 18 kDa Protein, welches aufgrund der Bindung des Benzodiazepines Flunitrazepam und der entsprechenden Größe das pflanzliche PBR-homologe Protein sein müßte (Lindemann et al., 2000).