5.1 Normoxie
5.1.1 Interaktion von p27 KIP1 mit PKC und RACK1
5.1.1.1 p27KIP1 interagiert mit RACK1 in einem Hefe-Zwei-Hybrid-System
Wie schon erwähnt spielt das Protein p27KIP1 in vielen Zellen eine Rolle in der Regulation des Zellzyklusstopps. Die, in diesem Zusammenhang bekannten Interaktionspartner, sind jedoch in adulten Kardiomyozyten herunterreguliert. Zur Identifizierung von Proteinen, die mit p27KIP1 in Kardiomyozyten interagieren, wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet. Zur Konstrukti-on des Köders wurde Wildtyp p27KIP1 in die Gal4-DNA-BD des Vektors pas2-1 fusioniert.
Abbildung 5-1. Schematische Darstellung des p27KIP1-Köder-Proteins:
Schematische Darstellung der Aminosäureseqenz mit bekannten
Interaktionsdomänen; Abk.: NES-nucleäre Exportsequenz; NLS-nucleäre Lokalisationssequenz
Bei der Durchmusterung einer adulten humanen Herzgendatenbank wuchsen 3,9x106 Transfor-manten. Mit diesen Kolonien wurde der ß-Galaktosidase-Test durchgeführt. Hier zeigten sich durch Blaufärbung innerhalb zweier Screens ingesamt 295 positive Klone. Alle positiven Klone wurden erneut gepickt und auf eine Platte vereinzelt. Anschließend wurde nochmals das Filter-liftverfahren angewandt. 57 Klone wiesen im ersten und zweiten Galaktosidasetest eine mittlere oder starke Blaufärbung auf. 39 Klone färbten sich zunächst schwach blau, aber nach Vereinze-lung stark an. Weitere 38 Klone zeigten nach anfänglich nur bläulichem Schimmer nach der Vereinzelung eine starke Blaufärbung. Das normale Beobachtungsintervall für die Anfärbung der Kolonien betrug 0,5 bis 3h. 28 Klone zeigten erst nach 24h im ersten oder zweiten Test eine leichte Blaufärbung. Klone, die im ersten Galaktosidasetest leicht gefärbt waren und im zweiten
übrig, die aus den Hefezellen wie beschrieben isoliert und dann in E.coli HB101/Leu-transformiert wurden. Aus 71 Klonen, die auf Leucinmangelmedium wuchsen, wurden die Plas-mide extrahiert und der Restriktionsanalyse unterzogen. Danach verblieben 53 Klone für die Sequenzierung. Nach Aufreinigung der DNA und Sequenzanalyse wurden die Ergebnisse mit dem Programm BLAST auf Übereinstimmungen mit bekannten Proteinen in verschiedenen Gendatenbanken untersucht. Einer dieser Klone zeigte in der Blastsuche eine 90%ige Sequenz-identität mit RACK1, einem Homolog zur -Untereinheit des G-Proteins von Rezeptoren und spezifischer Interaktionspartner von aktivierter PKC 2. Es handelte sich um die carboxytermina-len Aminosäuren 139-317 des Proteins RACK1.
Abbildung 5-2. Schematische Darstellung des RACK1-Beuteproteins:
Schematische Darstellung des carboxyterminalen Anteils des RACK1- Proteins in einem positiven Klon der mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System durchgeführten Durchmusterung einer kardialen Gendatenbank mit p27KIP1 als Köder.
Abbildung 5-3. Schematische Darstellung des Wildtypproteins von RACK1:
Schematische Darstellung des Wildtypproteins RACK1 mit den WD-40 Wiederholungen.
In einem -Gal-Liquid-Assay konnte die Spezifität der Bindung zwischen p27KIP1 und RACK1 nach Kotransformation von Hefezellen mit Gal4-AD-RACK1 und Gal4-BD-p27KIP1 Plasmiden bestätigt werden. Zur Einschätzung der Bindungsstärke zwischen p27KIP und RACK1 wurde vergleichend die Bindungsstärke der bekannten Interaktion von Wildtyp-p53 und SV40-T-large-Antigen bestimmt.
139 146 178 190 220 231 260 281 311 317
WD IV WD V WD VI WD VII
33 44 61 91 103 133 146 178 190 220 231 260 281 311 WD I WD II WD III WD IV WD V WD VI WD VII
1 317
Abbildung 5-4. Spezifität und Stärke der Bindung zwischen p27KIP1 und RACK1:
Durch Interaktion zwischen p27KIP1 und RACK1 entsteht in den Hefezellen ein GAL4-Aktivator, der zur Expression von ß-Galaktosidase im Hefe-Zwei-Hybrid-System führt. Die im ß-Galaktose-Flüssikeits-Assay erreichte Gelbfärbung wurde über Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 450nm quantifiziert. Balken 1 und 2: Ausschluss der Selbstaktivierung durch die eingesetzten Vektoren und p27KIP1; Balken 3: Positivkontrolle; Balken 4: p27KIP1 und RACK1 Interaktion;
Balken 5, 6 und 7: keine Interaktion zwischen RACK1 und p16INK4, p21WAF1 oder p57KIP2.
Im Gegensatz dazu waren die CKIs p16INK4, p21WAF1 und p57KIP2 nicht in der Lage mit RACK1 die Transkription des -Gal-Promotors auszulösen. Sie erreichten im Flüssigkeits-Test Absorpti-onswerte unter 0,1. Daraus lässt sich schließen, dass RACK1 nicht mit p16INK4, p21WAF1 oder p57KIP2 interagiert.
5.1.1.2 In-vitro-Assoziation von p27KIP1 und RACK1
Die Überprüfung der Spezifität der Bindung zwischen RACK1 und Wildtyp p27KIP1 erfolgte mittels eines GST-Bindungs-Assays. RACK1 und in-vitro-translatiertes p27KIP1 wurden zusam-men inkubiert und nach Elution der Überstand mittels Westernblot mit p27KIP1-Antikörpern un-tersucht. Wie in Abbildung 5-5, Bahn 3 zu erkennen, lässt sich Wildtyp p27KIP1 gebunden an RACK1 nachweisen. Gleiches zeigte sich im Umkehrversuch mit GST-markiertem Wildtyp p27KIP1 und HA-markiertem RACK1. Hier ließ sich, wie in Abbildung 5-6, Bahn 3 gezeigt, im
5.1.1.3 Charakterisierung der Bindungsdomänen von p27KIP1 und RACK1
Zur Verifizierung der Bindungsstelle von RACK1 an p27KIP1 erfolgte die Herstellung sechs re-kombinanter p27KIP1-Mutanten mittels PCR, die unterschiedliche Regionen des gesamten Prote-ins trugen. Mit diesen wurde ebenfalls ein GST-Bindungs-Assay durchgeführt. Die Westernblo-tanalyse zeigte, dass nur wildtyp.p27, p27.27-199 und p27.87-199 gebunden an RACK1 ausge-fällt werden konnten. Das deutet darauf hin, dass die Aminosäuren 186-199 die Interaktionsregi-on vInteraktionsregi-on p27KIP1 mit RACK1 bilden (Abbildung 5-5).
Abbildung 5-5. In-vitro-Verifizierung der Bindungsstelle für RACK1 an p27KIP1: Der Wildtyp von p27KIP1 und die sechs in-vitro-translatierten Mutanten wurden mit an GST-gebundenem RACK1 inkubiert und mit Westernblot unter Benutzung von anti-p27KIP1 nachgewiesen. Nur die Spalten 2,3,8 und 9 zeigen eine positive Interaktion.
In den darauffolgenden Experimenten sollte die Bindungsdomäne für p27KIP1 an RACK1 charak-terisiert werden. Die Analyse erfolgte ebenfalls in einem GST-Bindungs-Assay mit Haemagglu-tinin (HA) markiertem Wildtyp von RACK1 und vier in-vitro-translatierten Mutanten. Wie in Abbildung 5-6 dargestellt, konnten wildtyp.RACK1, RACK1.111-317 und RACK1.201-317 mit anti-HA-Antikörpern an GST gebundenem wildtyp.p27KIP1 nachgewiesen werden. Die Eluate aus den Reaktionsansätzen mit den Mutanten RACK1.1-100 und RACK1.1-200 zeigten keine Antikörperbindung im Westernblot. Somit gingen diese Mutanten keine Proteinbindung mit wilstyp.p27KIP1 ein. Dies bedeutet, dass sich die zuständige Domäne für die Bindung von RACK1 an wildtyp.p27KIP1 innerhalb der carboxyterminalen Aminosäuren 201-317 von RACK1 befindet.
Abbildung 5-6. In-vitro-Verifizierung der Bindungsdomäne von p27KIP1 an RACK1:
Wildtyp RACK1 und die vier in-vitro-translatierten Mutanten wurden mit Hämagglutinin markiert, mit GST-markiertem wildtyp.p27 inkubiert und durch Westernblot mit anti-HA-Antikörpern nachgewiesen. Nur die Spalten 2,3,6 und 7 zeigten eine positive Interaktion. Der die Bindungsstelle tragende Mutant ist in Spalte 7 zu sehen.
5.1.1.4 In-vitro-Assoziation von p27KIP1 und PKCC2
RACK1 gehört zu den Rezeptoren für aktivierte Proteinkinasen C (PKC) und ist ein spezifisches Anker- und Translokationsprotein für PKC 2 [68]. Somit stellte sich die Frage, ob p27KIP1 auch eine Bindung mit PKCC2 eingehen kann, und ob diese mit der RACK1-Bindungsdomäne interfe-riert. Im GST-Bindungs-Assay ließ sich wildtyp.p27 an GST-gebundener PKCC2 mittels Westernblot nachweisen (Abbildung 5-7, Bahn 3). Somit bindet wildtyp. p27KIP1 in vitro an PKCC2. Im Umkehrexperiment bestätigte sich dieses Ergebnis (Abbildung 5-8, Bahn 3).
5.1.1.5 Charakterisierung der Bindungsdomänen von p27KIP1 und PKCC2
Erneut erfolgte ein GST-Bindungs-Assay mit in-vitro-translatierten Mutanten von p27KIP1 und GST-markierter PKCC2. Im durchgeführten Westernblotverfahren unter Einsatz von p27KIP1 -Antikörpern ließen sich nur Konstrukte, die die cdk-Bindungsdomäne enthalten, also p27.1-86.
p27.1-151 und p27.1-102 an PKCC2 gebunden nachweisen (Abbildung 5-7, Bahn 5-7)
Konstruk-PKC 2 gebunden (Abbildung 5-7, Bahn 8, 9). Somit vermittelt die cdk-Bindungsdomäne von p27KIP1 auch die Bindung zu PKC 2.
Abbildung 5-7. In- vitro-Verifizierung der Bindungsstelle von PKCß2 an p27KIP1: An GST-gebundene PKCß2 wurde mit wildtyp.p27 und den sechs in-vitro-translatierten Mutanten inkubiert und durch Westernblot mit anti-p27KIP1 nachgewiesen. Die Spalte sieben zeigt den kürzesten, Bindungsstelle tragenden Mutanten.
Gleichermaßen wurde die p27KIP1-Bindungsstelle an PKC 2 untersucht. Von fünf in-vitro-translatierten, gekürzten und geschnittenen Mutanten von PKC 2 reagierte im GST-Bindungs-Assay nur wildtyp.PKC 2, PKC 2.500-673 und PKC 2.600-673 mit an GST immobilisiertem wildtyp.p27KIP1 (Abbildung 5-8, Bahn 2, 6 und 7). Die Konstrukte PKCC2.1-490, PKCC2.1-370 und PKCC2.600-630 gingen keine Bindung mit p27KIP1 ein (Abbildung 5-8, Bahn 4,5 und 8).
Daraus folgt, dass die carboxyterminalen Aminosäuren 630-673 von PKCC2 die Bindung an p27KIP1 ermöglichen.
Abbildung 5-8. In-vitro-Verifizierung der Bindungsstelle von p27KIP1 an PKCß2:
An GST-immobilisiertes wildtyp.p27KIP1 wurde mit wildtyp.PKCß2 und den fünf in-vitro-translatierten Mutanten inkubiert und im Westernblot mit
anti-PKCß2-Antikörpern nachgewiesen. Die Spalte sieben zeigt den kürzesten, Bindungsstelle tragenden Mutanten.
5.1.1.6 Endogenes p27KIP1 und RACK1 sind assoziiert in Kardiomyozyten
Nach gelungenem Nachweis der in-vitro-Bindung von p27KIP1 und RACK1 stellte sich die Frage, ob beide Proteine in Kardiomyozyten in vivo einzeln oder aneinander gebunden vorliegen. Dazu wurden zelluläre Extrakte von isolierten neonatalen ventrikulären Rattenherzmuskelzellen wie in 3.18.2 beschrieben hergestellt. Diese wurden in einem Immunoblot nacheinander mit spezifi-schen Antikörpern für RACK1 und p27KIP1 und, zur Bestätigung der Spezifität, mit Antikörpern für p21WAF1 und p16INK4 coimmunopräzipitiert. Wie in Abb.5-7, Bahn 3, zu sehen, ließ sich p27KIP1 in der Westernblotanalyse mit p27KIP1-Antikörpern in RACK1-Immunopräzipitaten nachweisen. Im Gegensatz dazu konnten p21WAF1 (Bahn 2) und p16INK4 (Bahn1) nicht mit den jeweils spezifischen Antikörpern in den RACK1-Immunopräzipitaten detektiert werden. Dies bestärkt die Annahme, dass die Assoziation von p27KIP1 und RACK1 spezifisch ist.
Abbildung 5-9. In-vivo-Assoziation von RACK1 und p27KIP1:
Zellextrakte aus isolierten vier Tage alten Wistar-Rattenkardiomyozyten wurden mit RACK1-Antikörpern immunopräzipitiert und anschließend im Westernblotverfahren und Immunoblot mit Antikörpern spezifisch für p27KIP1, p16INK4 und p21WAF1
analysiert. Bahn 1,2: p21WAF1 und p16INK4 können in den
RACK1-Immunopräzipitaten nicht nachgewiesen werden. Bahn 3: Nur p27KIP1-Antikörper binden an RACK1-Immunopräzipitate. Bahn 4: p27KIP1-Kontrolle. Bande IgGHC: ungebundene Antikörper; IP-Immunopräzipitation; WB-Westernblot.
Die Assoziation von endogenem p27KIP1 und RACK1 konnte in dem Umkehrexperiment (Abbildung 5-10, Bahn 3) bestätigt werden. Auch hier zeigte sich die Assoziation als spezifisch, weil weder p16INK4 noch p21WAF1 in den Immunopräzipitaten mit p27KIP1 nachweisbar waren (Abbildung 5-10, Bahn 1und 2).
Abbildung 5-10. In-vivo-Assoziation von p27KIP1 und RACK1:
Zellextrakte aus isolierten vier Tage alten Wistar-Rattenkardiomyozyten wurden mit p27KIP1-Antikörpern imunnopräzipitiert, mit dem Westernblotverfahren und
anschließend im Immunblot mit jeweils spezifischen Antikörpern für RACK1, p16INK4 und p21WAF1 analysiert. Bahn 1,2: p21WAF1 und p16INK4 können in den p27KIP1 Immunopräzipitaten nicht nachgewiesen werden. Bahn 3:
RACK1-Antikörper binden an p27KIP1-Immunopräzipitate. Bahn 4: RACK1-Kontrolle. Bande IgGHC: ungebundene Antikörper; IP-Immunopräzipitation; WB-Westernblot.
5.1.1.7 Endogenes p27KIP1 liegt in Kardiomyozyten assoziiert an PKC 2 vor
Da RACK1 als Shuttleprotein und Stabilisator für PKC 2 bekannt ist [69, 70] und wie gezeigt, mit PKC 2 und p27KIP1 interagiert, stellt sich die Frage, ob endogenes p27KIP1 in Kardiomyozy-ten ebenfalls mit PKC 2 assoziiert ist. Proteinkinasen C (PKC) bilden eine Gruppe von Se-rin/Threoninkinasen, bestehend aus zehn Isoformen, die in vielen Geweben mit einer zellspezifi-schen Verteilung vorkommen. Für Mitglieder der Untergruppe der klassizellspezifi-schen und der neuen PKC konnte bereits eine Aktivität in neonatalen und adulten Kardiomyozyten nachgewiesen werden [69, 71]. Deshalb erfolgte die Untersuchung stellvertretend für die jeweilige Untergruppe
geringe Kreuzreaktivität der PKC-Antikörper untereinander, so dass der Nachweis einer anderen PKC als PKC 2 ausgeschlossen werden kann.
Zu diesem Zweck wurden PKC , PKC 2 und PKC unter Verwendung Isoform-spezifischer Antikörper aus Zellextrakten vier Tage alter Wistar-Rattenkardiomyozyten immunopräzipitiert.
Wie in Abbildung 5-11 ersichtlich, enthielt das PKC 2 Immunopräzipitat signifikante Mengen von p27KIP1, während in den Versuchen mit Antikörpern spezifisch für PKC bzw. PKC unter vergleichbaren Bedingungen p27KIP1 nicht mit ausgefällt wurde. Die Assoziation von endogener PKC 2 mit CKIs ist beschränkt auf p27KIP1, denn p16INK4 und p21WAF1 konnten in zellulären Extrakten von anti-PKC 2-Immunopräzipitationen nicht nachgewiesen werden.
Abbildung 5-11. Endogenes p27KIP1 liegt gebunden an PKCß2 vor:
Zellextrakte von Kardiomyozyten, gewonnen von vier Tage alten neonatalen Wistarratten wurden mit spezifischen Antikörpern gegen p27KIP1 und die PKC-Isoformen, wie in der obersten Zeile angegeben, immunopräzipitiert. Nach Westernblotverfahren und Immunoblotting mit spezifischen Antikörpern gegen p27KIP1, p21WAF1 und p16INK4, ließ sich p27KIP1 nur an PKCß2 gebunden nachweisen.
Hingegen liegen p21WAF und p16INK4 nicht an PKC 2 gebunden vor.
5.1.2 Funktionelle Bedeutung der Interaktion von PKC 2 und p27KIP1