Inkubation mit Peptidoglycan und Endotoxin

4 Ergebnisse

Zeit gebildete IL-6 wurde mittels ELISA quantifiziert (Abbildung 28). Sowohl frisch differenzierte Zellen, als auch kryokonservierte zeigten einen von der Endotoxinkonzentra-tion abhängigen Anstieg der OD. Wie in vorherigen Experimenten, führt die InkubaEndotoxinkonzentra-tion mit LPS von E. coli 055:B5 zu höheren Extinktionen als der Standard RSE. Frische Makrophagen erreichten mit LPS einen Wert von 2,5 mit 2 EU ml^-1, kryokonservierte einen Wert von 2,7. Mit RSE lieferten die Makrophagen eine OD von 1,2 (frisch) bzw.

1,1 (kryokonserviert). Die Zellen zeigten unter beiden Bedingungen eine vergleichbare Reaktion auf LPS bzw. RSE, was in sehr ähnlichen Kurvenverläufen resultiert.

0.0 0.2 0.4 0 6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

Makrophagen LPS Makrophagen kryo. LPS Makrophagen RSE Makrophagen kryo. RSE

Abb. 28:IL-6 ELISA: 72 h Differenzierung, Kulturschale, kryokonserviert

Diese Abbildung zeigt die Extinktion über der LPS-Konzentration. Frisch diffe-renzierte Zellen sind in dunkler, kryokonservierte Makrophagen in heller Farbe dargestellt. Jeder Messpunkt stellt den Mittelwert aus einem Triplikat dar, die Standardabweichung ist als Fehlerbalken aufgetragen. In blau: Makrophagen mit LPS vonE. coli 055:B5; in orange: Makrophagen mit RSE.

4 Ergebnisse

wurde ein Wert von 1,2 (nur RSE) bzw. 1,1 (RSE & PGN) erreicht. Allerdings zeigte sich auch ohne Zugabe von RSE bereits eine OD von 0,4 (nur RSE) und 0,8 (RSE &

PGN). Beide Kurven zeigen einen ähnlichen Verlauf. Da eine Verstärkung der Reaktion von Makrophagen auf RSE durch Peptidoglycan nicht gezeigt werden konnte, kam diese Substanz in den weiteren Experimenten nicht zum Einsatz.

0.0 0.2 0.4 0 6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

Makrophagen RSE Makrophagen RSE & PGN

Abb. 29:IL-6 ELISA: 72 h Differenzierung, Kulturschale, Peptidoglycan

Diese Abbildung zeigt die Auftragung der Extinktion über der LPS-Konzentration.

In orange: Makrophagen mit RSE inkubiert; in dunkelorange: Makrophagen mit RSE & Peptidoglycan (PGN) inkubiert. Jeder Messpunkt stellt den Mittelwert aus einem Triplet dar, die Standardabweichung ist als Fehlerbalken aufgetragen.

4 Ergebnisse

4.4 72 h Differenzierung mit Ruhephase

THP-1 Zellen wurden mit 10 nM PMA für 72 h bei 37 ℃ und 5 % CO2 inkubiert, wie es in Abschnitt 3.1.5 beschrieben ist, um diese zu Makrophagen zu differenzieren. Es folgte eine Ruhephase von weiteren 72 h ohne PMA, da in der Literatur beschrieben wird, dass sich dadurch die Expression von für Makrophagen typischen Markern erhöhen lässt [38]. Makrophagen waren adhärent und zeigten eine spindelförmige Morphologie mit Ausläufern (Abbildung 30 rechts). Nicht differenzierte Zellen wiesen weiterhin eine runde Morphologie auf, auch Zelldebris war vereinzelt zu sehen. Im Vergleich zu einer 48 stündigen Differenzierung zeigten sich optisch eine deutlich höhere Anzahl an differen-zierten Zellen.

Abb. 30:Für 72 h differenzierte THP-1 Zellen und 72 h Ruhephase vs. 48 h Dif-ferenzierung

Diese Abbildung zeigt links THP-1 Zellen nach einer Differenzierung von 48 h mit 10 nM PMA. Und rechts zum Vergleich für 72 h mit 10 nM PMA differenzierte THP-1 Zellen in einer Zellkulturschale. An die Inkubation wurde nach einem Medienwechsel eine Ruhephase von 72 h angeschlossen. Makrophagen werden adhärent, weisen eine spindelförmige Morphologie auf und zeigen Ausstülpungen (blaue Pfeile). Nicht differenzierte Zellen zeigen eine runde Morphologie (weiße Pfeile) und Zelldebris ist ebenfalls zu erkennen. Das Bild wurde unter dem Phasenkontrastmikroskop bei 100-facher Vergrößerung aufgenommen.

4 Ergebnisse

Zellkulturschale abgelöst, mit Medium gewaschen und für eine Ruhephase von 72 h ohne PMA erneut ausgesät. Der Einfluss einer an die Differenzierung angeschlossenen Ruhe-phase ohne PMA auf den Differenzierungsstatus von Makrophagen wurde mithilfe einer Immunfluoreszenzfärbung gegen CD11b und CD14 am Durchflusszytometer untersucht.

In Abbildung 31 sind die Histogramme der Färbungen aufgetragen. Die Makrophagen zeigen bei den Kontrollen ohne Antikörper eine leichte Verschiebung im Vergleich zu undifferenzierten Zellen. Die Färbung von CD11b führte zu einem deutlichem Shift der Makrophagen zu nicht differenzierten Zellen (B2). Die Inkubation mit dem Antikörper gegen CD14 hatte, anders als in vorangegangenen Experimenten ebenfalls eine sehr deutliche Verschiebung der Fluoreszenzintensität zur Folge (B3 im Vergleich zu A3). Dies deckt sich mit Beschreibungen in der Literatur [38].

A1

Kontrolle

ohneRuhephase

A2

CD11b

A3

CD14

B1

mitRuhephase

B2 B3

Abb. 31:Differenzierungsstatus: 72 h, 72 h Ruhephase (mit Ablösung)

Die Abbildung zeigt die Histogramme einer Immunfluoreszenzfärbung gegen CD11b und CD14, die mit dem Durchflusszytometer gemessen wurden. In grün: für 72 h differenzierte Makrophagen ohne Ruhephase; in rot: für 72 h differenzierte Makro-phagen, mit einem Zellschaber abgelöst und für eine Ruhephase von 72 h erneut ausgesät; in blau: undifferenzierte THP-1 Zellen. Die Kontrollen ohne Antikörper zeigten nur eine leichte Verschiebung im Vergleich zu undifferenzierten THP-1 Zellen (A1 und B1). Der Antikörper gegen CD11b führte zu einem deutlichen Shift (A2 und B2). Die Färbung von CD14 (B3) lieferte ebenfalls eine deutliche Verschiebung der Fluoreszenzintensität bei Zellen mit Ruhephase.

Um die Empfindlichkeit von Makrophagen, die nach 72 h Differenzierung für eine Ruhe-phase von 72 h abgelöst und erneut ausgesät wurden, gegenüber Endotoxin zu testen,

4 Ergebnisse

wurden diese für 18 h mit LPS von E. coli 055:B5 bzw. mit RSE inkubiert. Das ge-bildete IL-6 wurde mittels ELISA quantifiziert. Rechts in der Abbildung 32 sind die resultierenden OD-Werte von frischen Makrophagen im Vergleich zu differenzierten Zellen ohne Ruhephase dargestellt, während Abbildung 33 die Ergebnisse kryokonservierter Zellen zeigt. Frische Makrophagen lieferten mitE. coli LPS einen sehr steilen Anstieg der OD bereits bei geringer Konzentration, ab 0,25 EU ml^-1 scheint eine Sättigung einzutreten, da die OD ab dieser Konzentration nahezu konstant hoch (um 3,5) blieb.

Bis 0,125 lag mit einem Bestimmtheitsmaß von 0,98 ein linearer Zusammenhang vor. Die Nachweisgrenze lag bei LPS von E. coli bei 0,025 EU ml^-1, das heißt, die OD, die sich bei der genannten Konzentration als Mittelwert ergab, war höher als der dreifache Wert der Standardabweichung. Der Detektionsbereich lag zwischen 0,025 und 0,25 EU ml^-1, also zwischen der Nachweisgrenze und dem Eintreten einer Sättigung, sofern ein linearer Zusammenhang vorliegt. Die Inkubation mit RSE hatte einen weniger steilen Anstieg der OD zur Folge, bis zu einer Konzentration von 0,75 EU ml^-1 stieg die Extinktion linear an. Die Regression wies ein Bestimmtheitsmaß von 0,97 auf. Bei 2 EU ml^-1 wurde eine OD von 3,3 erreicht. Die Nachweisgrenze von RSE lag bei 0,05 EU ml^-1 und der Detektionsbereich erstreckte sich bis 0,75 EU ml^-1. Durch eine Ruhephase im Anschluss der Differenzierung konnte die Funktionalität der Makrophagen erhöht werden, wie im Vergleich mit den IL-6 ELISA Ergebnissen einer 72 h Differenzierung ohne Ruhephase deutlich wird (links in der Abbildung 32).

4 Ergebnisse

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

THP-1 LPS Makrophagen LPS

THP-1 RSE Makrophagen RSE

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

Makrophagen LPS Makrophagen RSE

Abb. 32:IL-6 ELISA: 72 h Differenzierung, Kulturschale, 72h Ruhephase (mit Ablösung)

In dieser Abbildung ist die Extinktion über der LPS-Konzentration aufgetragen. Jede Konzentration wurde in Triplikaten gemessen und der Mittelwert zusammen mit der Standardabweichung als Fehlerbalken aufgetragen. Links: 72 h Differenzierung ohne Ruhephase; rechts: 72 h Differenzierung mit 72 h Ruhephase (mit Ablösung). In blau: Makrophagen mit LPS von E. coli 055:B5; in orange: Makrophagen mit RSE.

Kryokonservierte Makrophagen (Abbildung 33) zeigten ebenfalls einen von der Endo-toxinkonzentration abhängigen Anstieg der OD. Die Inkubation mit LPS von E. coli führte bis zu einer Konzentration von 0,5 EU ml^-1 zu einer linearen Beziehung (R² = 0,99), bei 2 EU ml^-1 war eine OD von 2,4 erreicht. Die Nachweisgrenze mit LPS lag bei 0,025 EU ml^-1, der Detektionsbereich ging bis 0,5 EU ml^-1. Kamen kryokonservier-te Makrophagen in Kontakt mit RSE, zeigkryokonservier-ten diese über den gesamkryokonservier-ten unkryokonservier-tersuchkryokonservier-ten Konzentrationsbereich einen linearen Anstieg der OD (R² ≈ 1) bis zu einem Wert von 1,3 bei 2 EU ml^-1. Die Nachweisgrenze lag bei reproduzierbar bei 0,05 EU ml^-1. Der Detektionsbereich erstreckte sich bis 2 EU ml^-1.

4 Ergebnisse

0.0 0.2 0.4 0 6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

Makrophagen kryo. LPS Makrophagen kryo. RSE

Abb. 33:IL-6 ELISA: 72 h Differenzierung, Kulturschale, 72h Ruhephase (mit Ablösung), kryokonserviert

In dieser Abbildung ist die Extinktion über der LPS-Konzentration aufgetragen. Jede Konzentration wurde in Triplikaten gemessen und der Mittelwert zusammen mit der Standardabweichung als Fehlerbalken aufgetragen. Die Zellen wurden für 72 h differenziert, anschließend mit einem Zellschaber abgelöst und für eine Ruhephase von 72 h ohne PMA erneut ausgesät und kryokonserviert. In blau: Makrophagen mit LPS von E. coli 055:B5; in orange: Makrophagen mit RSE.

4.4.2 Ablösung mit einem Zellschaber; Medienwechsel

Bei für 72 h differenzierte ZHP-1 Zellen wurde im Anschluss der Differenzierung das Medium gewechselt, sodass das PMA entfernt wurde. Es folgte eine Ruhephase von 72 h.

Der Differenzierungsstatus wurde am Durchflusszytometer untersucht, die Ergebnisse sind in Abbildung 34 im Vergleich zu Makrophagen, die für eine Ruhephase abgelöst und erneut eingesät wurden, dargestellt. Die Makrophagen zeigen bei den Kontrollen ohne Antikörper eine leichte Verschiebung im Vergleich zu undifferenzierten Zellen (B1). Die Färbung von CD11b führte zu einem deutlichem Shift der Makrophagen zu nicht diffe-renzierten Zellen (B2). Die Inkubation mit dem Antikörper gegen CD14 hatte ebenfalls eine sehr deutliche Verschiebung der Fluoreszenzintensität zur Folge (B3), welche sich nicht signifikant von der Verschiebung bei einer Ruhephase mit Ablösung (A3) unterschied.

4 Ergebnisse

A1

Ablösung

Kontrolle

A2

CD11b

A3

CD14

B1

Medienwechsel

B2 B3

Abb. 34:Differenzierungsstatus: 72 h, 72 h Ruhephase (Medienwechsel)

Die Abbildung zeigt die Histogramme einer Immunfluoreszenzfärbung gegen CD11b und CD14, die mit dem Durchflusszytometer gemessen wurden. In rot: für 72 h differenzierte Makrophagen mit einer Ruhephase von 72 h (abgelöst und neu ausge-sät). In türkis: für 72 h differenzierte Makrophagen mit einer Ruhephase von 72 h (nur Medienwechsel); in blau: undifferenzierte THP-1 Zellen. Die Kontrollen ohne Antikörper zeigten nur eine leichte Verschiebung im Vergleich zu undifferenzierten THP-1 Zellen (A1 und B1). Der Antikörper gegen CD11b führte zu einem deutlichen Shift (A2 und B2). Die Färbung von CD14 (A3 und B3) lieferte ebenfalls eine deutliche Verschiebung der Fluoreszenzintensität.

In Abbildung 35 unter A2 sind die Ergebnisse des IL-6 ELISAs von frischen Makrophagen dargestellt, während unter B2 die Ergebnisse kryokonservierter Zellen zeigt, jeweils im Vergleich mit für die Ruhephase abgelösten Zellen. Frische Makrophagen lieferten mit E.

coli LPS einen sehr steilen Anstieg der OD bis 0,75 EU ml^-1 mit einem Wert von 3,8.

Danach sinkt die OD auf einen Wert von 3,4. Bis 0,25 lag mit einem Bestimmtheitsmaß von 0,97 ein linearer Zusammenhang vor. Die Nachweisgrenze lag bei LPS vonE. coli bei 0,05 EU ml^-1. Der Detektionsbereich lag zwischen 0,05 und 0,25 EU ml^-1. Die Inkubation mit RSE hatte einen weniger steilen Anstieg der OD zur Folge, bis zu einer Konzentration von 1 EU ml^-1 stieg die Extinktion linear an. Die Regression wies ein Bestimmtheitsmaß von 0,98 auf. Bei 2 EU ml^-1 wurde eine OD von 3,1 erreicht. Die Nachweisgrenze von RSE lag bei 0,05 EU ml^-1 und der Detektionsbereich erstreckte sich bis 1 EU ml^-1.

4 Ergebnisse

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

Makrophagen LPS Makrophagen RSE A1

frisch

Ablösung

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

Makrophagen LPS Makrophagen RSE A2

Medienwechsel

0.0 0.2 0.4 0 6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

Makrophagen kryo. LPS Makrophagen kryo. RSE B1

kryokonserviert

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

Makrophagen LPS Makrophagen RSE B2

Abb. 35:IL-6 ELISA: 72 h Differenzierung, Kulturschale, 72h Ruhephase (Me-dienwechsel), kryokonserviert

In dieser Abbildung sind die Extinktionen über der LPS-Konzentration aufgetragen.

Jede Konzentration wurde in Triplikaten gemessen und der Mittelwert zusammen mit der Standardabweichung als Fehlerbalken aufgetragen. Die Zellen wurden für 72 h differenziert, abgelöst (linke Seite) bzw. das Medium gewechselt (rechte Seite), für eine Ruhephase von 72 h ohne PMA kultiviert und kryokonserviert. In blau:

Makrophagen mit LPS von E. coli 055:B5; in orange: Makrophagen mit RSE.

Kryokonservierte Makrophagen (B2) zeigten ebenfalls einen von der Endotoxinkonzen-tration abhängigen Anstieg der OD. Die Inkubation mit LPS von E. coli führte bis zu einer Konzentration von 0,5 EU ml^-1 zu einer linearen Beziehung (R² = 0,99), bei 2 EU ml^-1war eine OD von 2,6 erreicht. Die Nachweisgrenze mit LPS lag bei 0,05 EU ml^-1, der Detektionsbereich ging bis 0,5 EU ml^-1. Kamen kryokonservierte Makrophagen in Kontakt mit RSE, zeigten diese über den gesamten untersuchten Konzentrationsbereich

4 Ergebnisse

abgelöst und gewaschen führte das zu einem etwas steileren Anstieg der OD im Vergleich zu Zellen, bei denen lediglich ein Medienwechsel vorgenommen wurde (A1 im Vergleich zu A2). In beiden Fällen zeigten kryokonservierte Zellen nicht die gleiche Funktionalität wie frische Zellen (B im Vergleich zu A).

4.4.3 Ruhephase nach dem Auftauen

Wie in Abbildung 35 erkennbar, zeigten kryokonservierte, für 72 h differenzierte THP-1 Zellen, die nach der Differenzierung für eine Ruhephase von 72 h ohne PMA inkubiert wurden (mit Ablösung vor der Ruhephase oder nur mit einem Medienwechsel) eine nied-rigere OD im IL-6 ELISA und damit eine geringere Funktionalität als frische Zellen. Aus diesem Grund wurden die Makrophagen nach dem Auftauen für 24 h bei 37 ℃ inkubiert.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

Makrophagen LPS Makrophagen RSE A1

Ablösung

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

0 1 2 3 4

LPS-Konzentration in EU/ml OD450

Makrophagen LPS Makrophagen RSE A2

Medienwechsel

Abb. 36:IL-6 ELISA: 72 h Differenzierung, Kulturschale, 72h Ruhephase (mit Ablösung oder Medienwechsel), kryokonserviert, 24 h Ruhephase In dieser Abbildung sind die Extinktion über der LPS-Konzentration aufgetragen.

Jede Konzentration wurde in Triplikaten gemessen und der Mittelwert zusammen mit der Standardabweichung als Fehlerbalken aufgetragen. Die Zellen wurden für 72 h differenziert, mit einem Zellschaber abgelöst und und für eine Ruhephase von 72 h ohne PMA erneut ausgesät (A1), bzw. das PMA durch einen Medienwechsel entfernt (A2). Die kryokonservierten Zellen erhielten nach dem Auftauen eine weitere Ruhephase von 24 h. In blau: Makrophagen mit LPS von E. coli 055:B5; in orange:

Makrophagen mit RSE.

Auf der linken Seite von Abbildung 36 unter A1 sind die Ergebnisse des IL-6 ELISAs nach der Inkubation von LPS bzw. RSE mit Makrophagen, die vor der Ruhephase mit einem Zellschaber abgelöst wurden, dargestellt. LPS führte zu einem steilen Anstieg der OD, bis sich diese ab einer Konzentration von 0,75 EU ml^-1 bei einem Wert von 3,3. Bis zu

4 Ergebnisse

einer Konzentration von 0,25 EU ml^-1 liegt ein linearer Zusammenhang vor (R² = 0,95).

Die Nachweisgrenze mit LPS lag bei 0,025 EU ml^-1 und der Detektionsbereich erstreckte sich bis 0,75 EU ml^-1. Die Inkubation mit RSE hatte einen konzentrationsabhängigen Anstieg der OD zur Folge. Bis zu einer Konzentration von 1 EU ml^-1 liegt mit einem Bestimmtheitsmaß R² von 0,98 der Regression eine lineare Beziehung vor. Bei 2 EU ml^-1 wurde eine OD von 2,8 erreicht. Die Nachweisgrenze mit RSE lag bei 0,125 EU ml^-1, der Detektionsbereich ging bis 1 EU ml^-1.

Auf der rechten Seite von Abbildung 36 unter A2 sind die Ergebnisse des IL-6 ELISAs der kryokonservierten Makrophagen, die für 72 h differenziert wurden, für eine Ruhe-phase von 72 h inkubiert wurden (Medienwechsel) und nach dem Auftauen erneut eine Ruhephase von 24 h erhielten. Die Makrophagen, die LPS von E. coli ausgesetzt waren, zeigten einen steilen Anstieg der OD, bis diese ab einer Konzentration von 0,75 EU ml^-1 konstant bei 3,1 blieb. Die Linearität erstreckte sich ebenfalls bis 0,75 EU ml^-1 mit einem Bestimmtheitsmaß der Regression von 0,95. Auch der Detektionsbereich ging bis 0,75 EU ml^-1, die Nachweisgrenze lag bei 0,025 EU ml^-1. Eine Inkubation mit RSE führte zu einer geringeren Steigung, es zeigte sich eine Proportionalität zur eingesetzten Konzentration. Über den gesamten untersuchten Konzentrationsbereich lag eine lineare Beziehung mit einem Bestimmtheitsmaß der Regression von 0,98 vor, weshalb auch der Detektionsbereich bis 2 EU ml^-1 ging. Die Nachweisgrenze lag bei 0,05 EU ml^-1. Bei der höchsten gemessenen Konzentration lag die OD bei 2,8 EU ml^-1.

Die Ruhephase im Anschluss an den Auftauvorgang hatte bei den beiden untersuchten Bedingungen eine starke Steigung der OD und eine hohe Sensitivität zur Folge.

4.4.4 Lipoteichonsäure

Im Dokument Anpassung eines Monozyten-Aktivierungstests (MAT) für den Nachweis von Pyrogenen unter Verwendung von THP-1 Zellen (Seite 59-70)