Der inhibitorische Effekt von HVEM ist abhängig von der BTLA-Expressionsstärke

Nachdem in Kapitel 3.4.2 gezeigt werden konnte, dass die CD4⁺ T-Zellaktivierung stärker durch HVEM-Ig gehemmt wurde als die der CD8⁺ T-Zellen, sollte untersucht werden, ob diese auffallenden Unterschiede in der Suszeptibilität der T-Zellsubpopulationen gegenüber der HVEM vermittelten Inhibition auf inhärenten Eigenschaften dieser Zellentypen beruhten, oder aber durch die unterschiedliche Expression des HVEM-Bindungspartners BTLA (Kap.

3.2.4.3) bewirkt wurden. Um dieser Frage nachzugehen, wurde der Einfluss von HVEM auf die Aktivierung von T-Zellen untersucht, die verschiedene Mengen an BTLA auf der Zell-oberfläche exprimierten. Dafür wurden T-Zellen aus den in Abschnitt 3.3 beschrieben genetisch veränderten Mäusen verwendet.

3.4.4.1 Die Reduktion der BTLA Oberflächenexpression auf T- Zellen verringert die HVEM vermittelte Inhibition der Zellaktivierung

Zuerst wurde untersucht, wie sich eine Verringerung der BTLA-Oberflächendichte auf die von HVEM vermittelten Signale während einer TZ-Aktivierung auswirkt. Dazu wurde die Aktivierung von T-Zellen aus wt (BTLA^+/+), heterozygoten BTLA^+/− und BTLA-defizienten (BTLA^−/−) Mäusen in Gegenwart von HVEM untersucht (Abb. 26).

Abb. 26: Abhängigkeit der von HVEM vermittelten Suppression von BTLA – BTLA-defiziente T-Zellen A) Vergleich der BTLA-Expression auf ex vivo T-Zellen von wt (BTLA+/+), heterozygoten (BTLA+/−) und BTLA-defizienten (BTLA−/−) Mäusen. B–D) Reduktion der TZ-Suppression über HVEM mit abnehmender BTLA-Expression auf den T-Zellen. Die Zellen wurden wie in Abb. 24 stimuliert und anschließend durchflusszytometrisch analysiert. B+C) Zellproliferation und Aktivierung von CD4⁺ T-Zellen der entsprechenden Mäuse in Anwesenheit von HVEM-Ig (schwarze Graphen) oder Kontroll-Ig (graue Graphen) bei 1000 ng/ml anti-CD3 mAK (B) oder in Abhängigkeit von der anti-CD3 mAK Konzentration. D) Expression von CD25 auf CD8⁺ T-Zellen der entsprechenden Mäuse bei Stimulation mit 1000 ng/ml anti-CD3 mAK. Die Zellproliferation und CD25-Expression ist nach 66 h Stimulation dargestellt, die CD69 Expression nach 20 h Stimulation. Gezeigt ist ein Ergebnis von mindestens 2 weiteren Experimenten.

T-Zellen aus BTLA^+/− Mäusen exprimierten verglichen mit T-Zellen aus wt Mäusen genau die Hälfte der normalen BTLA Menge auf der Zelloberfläche (Abb. 26 A). Wie in Abb. 26 (B/C) gezeigt, war die HVEM vermittelte Suppression von CD4⁺ T-Zellen aus den BTLA^+/− Tieren verglichen mit der von wt T-Zellen deutlich geringer, eher vergleichbar mit der auf wt CD8⁺ T-Zellen festgestellten. Es sei an dieser Stelle daran erinnert, dass sich auch CD4⁺ und CD8⁺ TZ aus wt Mäusen in ihrer BTLA-Expression um den Faktor 2 unterscheiden (Abb. 17). Eine Reduktion der BTLA-Expression auf die Hälfte des normalen wt Niveaus auf CD4⁺ T-Zellen, führte also zu deutlich weniger Inhibition der Aktivierung und Proliferation durch HVEM.

Des Weiteren wurde bei BTLA-defizienten T-Zellen die Blockade der T-Zellaktivierung durch HVEM-Fusionsprotein beinahe vollständig aufgehoben, die T-Zellaktivierung war sogar mit der Kontrollstimulation vergleichbar, was zeigte, dass BTLA für die starke durch HVEM vermittelte Inhibition notwendig war. Gleiche Tendenzen waren auch auf CD8⁺ TZ-Seite festzustellen. Da aber bereits die Aktivierung von wt CD8⁺ T-Zellen deutlich weniger durch HVEM beeinflusst wurde (Kap 3.4.2), war hier der Einfluss einer reduzierten BTLA-Menge bei weitem nicht so ausgeprägt. Wie am Beispiel von CD25 gezeigt, konnte jedoch auch bei der CD8⁺ TZ-Aktivierung ein veränderter HVEM Einfluss durch Reduktion der BTLA-Expression beobachtet werden (Abb. 26 D). In Gegenwart von HVEM-Ig war die durch Aktivierung induzierte CD25 Expression auf wt TZ signifikant reduziert, während diese Expression bei CD8⁺ TZ aus BTLA^+/− Mäusen deutlich weniger inhibiert wurde. Folglich sinkt mit geringerer BTLA-Expression auf den T-Zellen auch die suppressive Wirkung von HVEM-Ig auf die T-Zellaktivierung.

3.4.4.2 Durch verstärkte BTLA-Expression auf den T-Zellen nimmt die negative Wirkung von HVEM vermittelten Signalen zu

Um den Einfluss der BTLA-Expressionsstärke auch auf die Inhibition der CD8⁺ T-Zell-aktivierung genauer untersuchen zu können, und andererseits sicherzustellen, dass für die Wirkung von BTLA nicht allein ein bestimmter Schwellenwert der Oberflächenexpression ausschlaggebend war, wurden im gleichen experimentellen System zusätzlich T-Zellen mit gesteigerter BTLA-Expression auf der Zelloberfläche analysiert. Hierfür wurden die T-Zellen aus heterozygoten BTLAtg Mäusen isoliert, die verglichen mit wt T-Zellen etwa 10-fach mehr BTLA auf der Zelloberfläche exprimierten (Vgl. Abb. 22). Die normale Regulation des zusätzlichen BTLA-Transgens parallel zu endogenem BTLA (wodurch die Differenz der BTLA-Expression zu wt TZ auch während der T-Zellaktivierung erhalten blieb) wurde bereits in Kapitel 3.3.2 beschrieben. So wie die verringerte BTLA-Expression auf T-Zellen von

BTLA-defizienten Tieren zu einer abgeschwächten negativen Wirkung von HVEM-Ig führte (Kapitel 3.4.4.1), verstärkte die höhere Expression von BTLA auf den T-Zellen der BTLA-transgenen Mäuse die HVEM-vermittelte Suppression sowohl von CD4⁺ als auch CD8⁺ TZ (Abb. 27). Da bereits die Proliferation von wt CD4⁺ TZ vollständig in Anwesenheit von HVEM verhindert wurde, war die verstärkte Inhibition der Aktivierung von BTLAtg CD4⁺ TZ nur auf Ebene verschiedener Aktivierungsmarker zu beobachten. Darüber hinaus wurde nun auch bei CD8⁺ TZ aus BTLAtg Mäusen in Gegenwart von HVEM eine starke Inhibition der Expression verschiedener Aktivierungsmarker (Abb. 27 B) und eine vollständige Blockade der TZ-Proliferation (Abb. 27 A) festgestellt. Die starke Suppression der T-Zell-aktivierung durch HVEM war demnach bei hoher BTLA-Expression auf der Zelloberfläche ebenso auf CD8⁺ TZ wie auf CD4⁺ TZ zu erreichen.

Abb. 27: Abhängigkeit der von HVEM vermittelten Suppression von der BTLA-Expression – Überexpression von BTLA auf den T-Zellen

Vergleich der suppressiven Wirkung von HVEM-Ig auf CD4⁺ (obere Reihe) und CD8⁺ T-Zellen (untere Reihe) aus heterozygot BTLAtg Mäusen oder C57BL/6 wt Tieren. Die Zellen wurden wie in Abb. 24 beschrieben stimuliert, und anschließend durchflusszytometrisch analysiert A) Proliferation der T-Zellsubpopulationen aus den angegebenen Mäusen in Abhängigkeit von der anti-CD3 mAK Konzentration nach 66 h Stimulation und B) Expression von CD69 und CD25 nach 22 h Stimulation mit 1000 ng/ml anti-CD3 mAK in Anwesenheit von HVEM-Ig (schwarz) oder Kontroll-Ig (grau). Die Anteile positiver Zellen für den entsprechenden Aktivierungsmarker bezogen auf die jeweilige T-Zellpopulation sind über jedem Plot angegeben, die Quadranten für die Analyse wurden an unstimulierten Zellen ausgerichtet (nicht gezeigt). Dargestellt ist ein Ergebnis von mindestens 2 weiteren Experimenten.

Diese Daten zeigen deutlich, dass die geringere Wirkung von HVEM vermittelten Signalen auf wt CD8⁺ TZ und gleichzeitig stärkere Wirkung auf CD4⁺ TZ keine inhärente Eigenschaft dieser Zellpopulationen ist, sondern durch Variation der Expressionsstärke von BTLA veränderbar war, und folglich durch die unterschiedliche BTLA-Expression auf den entsprechenden T-Zellsubpopulationen bewirkt wurde. Allerdings sollten in diesem

Zusammenhang auch andere Interaktionspartner von HVEM nicht außer Acht gelassen werden, die ebenfalls an der T-Zellsuppression beteiligt sein könnten.

3.4.5 Potentielle Rolle anderer HVEM-Liganden bei der Suppression