Inhibition of Pin1 impairs localization of Cdc20 to kinetochores

Several reports indicate kinetochore localization of Cdc20 during mitosis: This localiza‐

tion  is  established  during  prophase  and  abolished  upon  anaphase  onset  (Kallio  et  al.,  2002).  Furthermore  localization  at  the  kinetochores  has  been  described  for  all  MCC  components (Vigneron et al., 2004). However, it is not clear yet, whether Cdc20 localiza‐ Cdc20  signals  were  visibly  reduced  by  Pin1‐immunodepletion  (Fig.  25B).  However,  using this approach it was not possible to clarify whether Pin1 directly influences Cdc20  localization  to  kinetochores,  as  most  Cdc20  was  co‐depleted  from  the  extract  upon  Pin1‐immunodepletion (Fig. 25C). Hence, it was decided to address the issue of a pos‐

RESULTS    slightly reduced compared to mock (GL2) treatment (Fig. 26). Similar effects could be  observed  in  mitotically  arrested  Hela  cells  treated  with  Pin1  inhibitor  DTM  (data  not  shown). However, also in these approaches it cannot be excluded that treatment of the  cells with RNAi or inhibition of Pin1 by DTM induces side effects such as co‐depletion of  Cdc20. It is furthermore possible that reduced Cdc20 levels at the kinetochores during  mitosis are an indirect effect of Pin1 depletion. 

To address the issue whether Pin1 directly influences Cdc20 localization, stable trans‐

genic  cell  lines  were  generated  inducibly  expressing  wildtype  Cdc20  (Cdc20^WT)  or  a  variant thereof lacking all Cdk1 phosphorylation sites (Cdc20^7A). In a previous experi‐

ment, this variant failed to associate with Pin1 (Fig. 22B). After a mitotic shake‐off, cells  were prepared for immunofluorescence analysis using antibodies against Cdc20 and the  kinetochore marker Hec1. Using this approach, localization of both wildtype Cdc20 and  Cdc20^7A to the kinetochores was observed, indicating that Pin1 does not directly influ‐

ence Cdc20 distribution to the kinetochores (Fig. 27A). 

Hence, the question was raised, whether there are other mechanisms that direct Cdc20  to the kinetochores as Pin1 didn’t seem to directly contribute to Cdc20 localization. To  this end, Hela wells were transfected with plasmids coding for different Cdc20 variants  shown in Fig. 27B and arrested in mitosis with nocodazole. Thereafter, immunofluores‐

cence  analysis  of  the  corresponding  cells  was  performed  and  localization  of  Cdc20  to  the kinetochores was analyzed. Cdk1‐ and Bub1‐phosphorylation deficient Cdc20 vari‐

ants still showed association with kinetochores, indicating that phosphorylation is not a  prerequisite for proper Cdc20 localization. (Fig. 27C‐E). However, a C‐terminally trun‐

cated variant failed to localize to kinetochores, whereas a Cdc20 variant lacking the last  two amino acids (unable to mediate association with Cdc27 or MCC component BubR1),  still showed localization. 

In  conclusion,  Pin1  does  not  seem  to  directly  influence  Cdc20  localization  to  kineto‐

chores during mitosis. The localization of Cdc20 to kinetochores is neither controlled by  phosphorylation nor by cis‐trans isomerization. Instead it is regulated by an unknown  mechanism, which requires the C‐terminal end of Cdc20. 

RESULTS   

Fig. 25: Pin1 depletion from CSF extract reduces the amount of total and kinetochore‐associated   Cdc20: (A) Experimental outline of the experiment. In brief, CSF extract was immunodepleted with  anti‐xPin1 antibodies or unspecific IgG (mock) and then supplemented with low amounts of sperm  nuclei and rhodamine labeled tubulin. After an incubation period of 30 min at 18°C, the sperm nuclei  were re‐isolated and analyzed by immunofluorescence microscopy (B) Upper panels: Representative  IF pictures of re‐isolated chromatin from mock or Pin1 depleted CSF extract. Chromatin was stained  using antibodies against the centromere marker xCenpA (red) and Cdc20 (green). DNA was counter‐

stained with Hoechst 33342. Scale bar is 20 µm. Lower panels: Representative IF pictures of extract  samples  taken  after  the  depletion  process.  DNA  was  counterstained  with  Hoechst  33342.  Rhod‐

amine  labeled  tubulin  is  shown  in  red.  Scale  bar  is  20  µm. (C)  Extract  samples  taken  after  immu‐

nodepletion were subjected to an immunoblot analysis using antibodies against xCdc20, α‐tubulin  and xPin1. 

 

!"#$%$&'()

*'(+) ,-./01)

!"#$%&'()))*+( ,#-./( ,0$+1( 2#34#(

2"$5(

678-9(

62"$5( 678-9(

:;'3<$'(<=#3(0#.>#?"-(

@ABA>8-(

CD/(

'22$(3.45&463()37) 4(.384(3$9)*'(+)3:) /3(;:3&).45&463()<23/=>)

?..'63()37)954:2)($/&4')

@(.):A3.@2'(4)&@%4&4.);$%$&'() -A:32@6():4"'93&@63()

-BC)4,;:@/;)

D22$(3E$3:49/4(/4)@(.) )'22$(3%&3F(8)

@(@&G9'9)37)-./01)

/( E(

,(

RESULTS   

  Fig. 26: Pin1 depletion reduces the amount of kinetochore‐bound Cdc20 in Hela cells. (A‐C) Hela  cells were transfected with siRNAs directed against Pin1 mRNA (Pin1 M) or mock transfected (GL2)  for 48 h. Following treatment with nocodazole for 14 h, mitotic cells were harvested by shake‐off. 

Cells were then either spun on coverslips, fixed and stained for immunofluorescence microscopy or  prepared  for  immunoblot  analysis. (A)  Immunofluorescence  pictures  of  the  corresponding  cells  stained  with  antibodies  against  Cdc20  (green)  and  CREST  as  a  marker  for  centromeres  (red).  DNA  was stained with Hoechst 33342. Scale bar is 10 µm. (B). Lysates of mitotic cells were analyzed by  SDS‐PAGE and immunoblotting to assay efficiency of Pin1 depletion by RNAi. Mitotic cells (50 each)  with kinetochoric (localized) and no detectable Cdc20 signal (not localized) were counted. Numbers  are presented in a table (C). 

   

!"#$%

&'()*)+"#%

,+-% !"#$%.%

,/-%

!"#$%

0123456% 783-9% 7:;<(% =2>?2%

5":@A% !"#$!%&'() *"+)!"#$!%&'()

,/-% -B% -B%

!"#$%.% $B% CB%

,)

-) .)

RESULTS   

 

Fig. 27: A Cdc20 variant with all Cdk1 sites mutated still localizes to kinetochores during SAC sig‐

nalling, however a C‐terminally truncated variant does not. (A) Stable transgenic Hela cell lines that  express  Myc‐tagged  wildtype  Cdc20  (Cdc20^WT)  or  a  variant  lacking  all  Cdk1  phosphorylation  sites  (Cdc20^7A) were arrested in mitosis with a double thymidine‐nocodazole block. After mitotic shake‐

!"#$!%&'()

*"+)

!"#$!%&'()

,"'#-.+) 25678) /!$012(#34) 9':0')

!"

/!$0) /!$012(#34

>8)

/!$012(#34?2)/!$012(#34

<@)

/!$012(#34

ABC)

D18EFE!%*)

/!$012(#34?G5)/!$012(#34

;1;<H

&'()*+,&*" -'&.-/012" ('*"-'&.-/012"

/!$0) 4) L4)

/!$012(#34^>8) ;M) ;3)

/!$012(#34?G5) ;J) ;H)

/!$012(#34?2) 4) L4)

/!$012(#34^<@) ;H) ;J)

/!$012(#34^ABC) <) 3L)

/!$012(#34^;1;<H) 4) L4)

/!$012(#34^;<=1'*() ;J) ;H)

3"

CI#J12(#34>8) CI#J12(#34<@) CI#J12(#34>8) CI#J12(#34<@)

>8)

RESULTS    off,  cells  were  harvested  and  transferred  to  fresh  medium  containing  nocodazole  plus  doxycyclin  (+Tet) or the corresponding carrier, ethanol (‐Tet). After 6 h of incubation, cells were harvested and  localization as well as expression of the transgenes were analyzed by immunofluorescence and im‐

munoblot  analysis.  Left  panel:  Immunoblot  analysis  of  total  cell  lysates  with  anti‐Myc  and  anti‐α‐

tubulin  antibodies.  Right  panel:  Immunofluorescence  pictures  of  the  corresponding  cells  stained  with antibodies against the kinetochore marker Hec1 (green) and the Myc epitope (red). DNA was  stained with Hoechst 33342. (B) Schematic representation of Cdc20 variants (WT=wild type, IR= C‐

terminally truncated variant with last two amino acids Ile and Arg removed, ΔC= C‐terminally trun‐

cated variant with the last 29 amino acids deleted, 7A= Cdk1 phosphorylation‐site deficient, BPM= 

Bub1 phosphorylation‐site deficient). The red circles indicate the positions of mutations introduced  to destroy Cdk1 or Bub1 phosphorylation sites. (C‐E) Hela cells were transfected with plasmids cod‐

ing for different N‐terminally Flag tagged Cdc20 variants (shown in B), arrested in mitosis with no‐

codazole  and  harvested  by  mitotic  shake‐off.  Thereafter,  cells  were  subjected  to  immunoblot  and  immunofluorescence analysis (C) Representative IF pictures of mitotic cells stained with antibodies  against  the  Flag  epitope  (green)  and  CREST  as  a  marker  for  centromeres  (red).  DNA  was  counter‐

stained with Hoechst 33342. Scale bar is 10 µm. (D) Immunoblot analysis with anti‐Flag and anti‐α‐

tubulin antibodies (E) Mitotic cells (30 each) with kinetochoric‐associated (localized) or no detect‐

able Flag signal (not localized) were counted. Numbers are presented in a table. 

 

Im Dokument The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 is required for maintenance of the spindle assembly checkpoint (Seite 67-72)