3.5 Färbung
3.5.6 Infektion von Neuronen
Zur Herstellung der Viren und der nachfolgenden Infektion der Neuronen er-folgte aus Gründen der Effizienz die Beschränkung auf die beiden Vektoren +798 und +810. Die Reduktion auf diese beiden Vektoren erfolg-te aufgrund der analysiererfolg-ten durch Calciumeinstrom induziererfolg-ten Ströme, da Zellen, welche mit diesen beiden Vektoren transfiziert worden waren, die bes-ten Resultate erzielt hatbes-ten.
Die infizierten Neurone wurden unter Verwendung der etablierten Parameter, Inkubationszeit 30 min, Temperatur 20 °C, 0,5 µM Sfp, 5 µM Substrat, gefärbt und im Konfokalmikroskop analysiert. Als Kontrolle dienten Neuronen, welche vorher nicht infiziert worden waren (Abb. 3.38 – 3.40).
Abb. 3.38 Neuron, infiziert mit +798: Inkubation 30 min, 5 µM Substrat, 0,5 µM Sfp, 20 °C
75 Abb. 3.39 Neuron, infiziert mit +810: Inkubation 30 min, 5 µM Substrat, 0,5 µM Sfp, 20 °C
Abb. 3.40 Neuron, nicht infiziert: Inkubation 30 min, 5 µM Substrat, 0,5 µM Sfp, 20 °C
Auch nach Analyse dieser Ergebnisse war es nicht möglich, sich abschließend festzulegen, ob es hierbei zu einer spezifischen Anfärbung der Calciumkanäle gekommen ist. Trotz der anfangs relativ überzeugenden Färbung der Zell-membran der Neuronen (Abb. 3.38 und 3.39) erbrachte die konfokalmikro-skopische Analyse der Kontroll-Neuronen, welche nicht infiziert worden waren, dass diese ähnlich wie die infizierten Neuronen zahlreiche Fluoreszenzfarb-stoffkonglomerate aufwiesen (Abb. 3.40). Aus diesem Grund war es sehr schwer zu unterscheiden, ob es sich bei den Konglomeraten der infizierten Neuronen um gefärbte Calciumkanäle oder eher um eine unspezifische Fär-bung handelte.
Zur Klärung des Sachverhalts wurde die Spezifität der Färbung erhöht, indem das Experiment wiederholt worden ist, es diesmal jedoch mit einer
Kombinati-76 on aus zwei unterschiedlichen, parallelen Färbemethoden durchgeführt wor-den ist. Es wurde zu diesem Zweck allerdings das Ziel verlassen, lebende Zellen zu färben, da als zweite Färbungsmethode eine Antikörperreaktion mit fixier-ten Zellen gewählt wurde.
Die Neuronen wurden zunächst mithilfe des gleichen Protokolls, wie es für das Labeling der Neuronen in den vorangegangenen Experimenten benutzt wor-den war, gefärbt. Anschließend wurwor-den diese Zellen fixiert. Daraufhin erfolgte die Applikation eines spezifischen Antikörpers gegen VGlut1, einen Gluta-mattransporter der Vesikel, in Kombination mit dem an den Sekundärantikör-per GaGp gebundenen Fluoreszenzfarbstoff Alexa 647.
Auf diese Weise sollten zum einen die ACP-Tag-tragenden Calciumkanäle mithilfe des CoA-Substrates und zum anderen der Glutamattransporter VGlut1 mithilfe von Anti-VGlut1 und GaGp A647 mit Fluoreszenzmolekülen markiert werden.
Das Ziel war es, bei einer Korrespondenz der durch beide Fluoreszenzfarbstoffe angefärbten Areale der Zellmembran Rückschlüsse auf die Herkunft der Sig-nale ziehen zu können.
Korrespondierende Fluoreszenzsignale sowohl bei 547 nm (ACP-Tag) als auch bei 647 nm (VGlut1 der Vesikel) würden die Vermutung nahe legen, dass tat-sächlich Calciumkanäle mit assoziierten Vesikeln markiert wurden (Abbildun-gen 3.41 und 3.42).
a.) b.)
Abb. 3.41 Neuron, infiziert mit +798 sowie Applikation des Antikörpers Anti-VGlut1: In-kubation 30 min, 5 µM Substrat, 0,5 µM Sfp, 20 °C, Aufnahmen bei 547 nm – ybbR-Tag (a.) so-wie bei 647 nm – Anti-VGlut1 (b.)
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Abb. 3.42 Überlagerung der Aufnahmen bei 547 nm und 647 nm (ybbR-Tag bzw. Anti-VGlut1)
a.) b.)
Abb. 3.43 Neuron, infiziert mit +810 sowie Applikation des Antikörpers Anti-VGlut1: In-kubation 30 min, 5 µM Substrat, 0,5 µM Sfp, 20 °C, Aufnahmen bei 547 nm – ybbR-Tag a.) so-wie bei 647 nm – Anti-VGlut1 (b.)
78 Abb. 3.44 Überlagerung der Aufnahmen bei 547 nm und 647 nm (ybbR-Tag [grün] bzw. Anti- VGlut1 [rot], Überlagerung [gelb])
Abb. 3.45 Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 3.44
Die ersten Bilder der auf diese Weise gefärbten Neuronen sahen zunächst sehr vielversprechend aus. Es konnten vor allem in den Dendriten und Axonen der Neuronen Bereiche mit einer starken Farbstoffanreicherung identifiziert wer-den, welche anfangs die Vermutung nahe legten, dass es sich hierbei um Konglomerate einer Vielzahl von Calciumkanälen samt Vesikeln handeln könnte. Dies wurde, wie weiter oben erwähnt, dadurch unterstützt, dass die Farbstoffanreicherungen bei 547 nm, also der Wellenlänge des CoA-ACP-Substrates, sich genau an denselben Stellen befanden wie auch die Konglo-merate bei 647 nm, der Wellenlänge des VGlut1-Antikörperfarbstoffes.
Als Kontrolle erfolgte daraufhin die Färbung nicht infizierter Neurone (Abb. 3.46).
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a.) b.)
Abb. 3.46 Neuron, nicht infiziert, nicht gefärbt, Anti-VGlut1: Inkubation 30 min, 5 µM Substrat, 0,5 µM Sfp, 20 °C, Aufnahmen bei 547 nm – ybbR-Tag (a.) sowie bei 647 nm – VGlut1 (b,)
Abb. 3.47 Überlagerung der Aufnahmen bei 547 nm und 647 nm (ybbR-Tag [grün] bzw. Anti-VGlut1 [rot], Überlagerung [gelb])
Bedauerlicherweise traten auch bei der Färbung der nicht infizierten Neuro-nen korrespondierende Farbstoffanreicherungen auf (Abb. 3.47).
Dies ließ vermuten, dass diese Anreicherungen im Bereich der Dendriten und Axone, welche bei einer Wellenlänge von 547 nm identifiziert werden konn-ten, durch eine spektrale Überlappung (blead-through) der durch die VGlut1/GaGp-A647-Antikörperfärbung entstandenen Fluoreszenzfarbstoff-konglomerate hervorgerufen werden könnten. Das würde bedeuten, dass es auch in diesem Falle zu keiner reproduzierbaren spezifischen Färbung der Calciumkanäle gekommen war.
Als Fazit aller Versuche, Calciumkanäle mithilfe der ACP-Tag-Methode anzu-färben, musste leider festgehalten werden, dass dieses Verfahren für diesen
80 Zweck nicht geeignet und nicht zielführend gewesen war. Es wurde daher ein alternativer Versuchsaufbau gewählt.
3.5.7 STED-Mikroskopie
Die Experimente wurden so modifiziert, dass sie mithilfe der STED-Mikroskopie durchgeführt werden konnten (siehe Kapitel 2.7.5 und 2.9).
Eine Infektion der Neuronen wurde nicht benötigt (Abb. 3.48 – 3.51).
Abb. 3.48–3.51
Primärneuronen, gefärbt mit Anti-VGlut1 (1:5.000), Anti-CaVext 1:100, Anti-Guineapig Alexa 488 (1:500) und Anti-rabbit Atto 647N (1:100), 20 °C, 30 min
a.) b.)
Abb. 3.48 Primärneuronen, gefärbt,konfokalmikroskopische Aufnahme: Wellenlänge 647 nm - CaVext (a.) sowie 488 nm – Anti-VGlut1 (b.)
Abb. 3.49 Überlagerung der Aufnahmen bei 488 nm und 647 nm (Anti-VGlut1[grün] bzw.
CaVext [rot], Überlagerung [gelb])
81 Abb. 3.50 Ausschnittsvergrößerungen aus Abb. 3.49
Abb. 3.51 Überlagerung der Ausschnittsvergrößerungen bei 488 nm und 647 nm im STED-Mikoskop (Anti- VGlut1[grün] bzw. CaVext [rot]), Verwendung der Avalanche Photo Diode
Beim Betrachten der Abbildungen 3.48 – 3.51 ließ sich erkennen, dass das STED-Prinzip funktionierte. Das Auflösungsvermögen des STED-Mikroskops (Abb.
3.51) übertraf das des konventionellen Konfokalmikroskops (Abb. 3.50) deut-lich.
Anfangs wurde dieses Resultat positiv bewertet, da davon ausgegangen wurde, dass mithilfe des STED-Mikroskops tatsächlich ein detailreiches Bild der Calciumkanäle erzeugt werden konnte (Abb. 3.51).
Weiterführende Untersuchungen im Elektronenmikroskop zeigten jedoch, dass die Farbstoffkonglomerate, welche im STED-Mikroskop identifiziert werden konnten, auf eine unspezifische Bindung der Antikörper innerhalb der
dendriti-82 schen Dornfortsätzen der Neuronen zurückzuführen waren (Abb. 3.52) [PEDERSEN 2009].
Aufgrund dieses Resultats war wiederum davon auszugehen, dass es auch in diesem Falle zu keiner spezifischen Färbung der an der präsynaptischen Zell-membran der Neuronen befindlichen P/Q-Typ-Calciumkanäle gekommen war.
Dieses endgültig als negativ zu wertende Ergebnis führte schließlich zu dem Entschluss, alle Experimente an dieser Stelle abzubrechen. Es musste resümiert werden, dass eine Visualisierung der P/Q-Typ-Calciumkanäle mit den gewähl-ten Methoden nicht zufriedenstellend durchführbar war.
Abb. 3.52 Farbstoffkonglomerate im dendritischen Dornfortsatz (EM-Bild, Vergrößerung 30.000x) Zu erkennen sind ein Dendrit einer Purkinje-Zelle (blau), die aktiven Zonen an diesen Dendriten (lila) sowie die umgebenden Gliazellen (grau). Die Farbstoffkonglomerate
(schwarz) sind nicht in den aktiven Zonen, in welcher sich die Mehrzahl der Calciumkanäle befindet, konzentriert, sondern sind relativ diffus im Dendriten verteilt. (Diese Aufnahme wurde freundlicherweise von Frau Dr. Pedersen zur Verfügung gestellt.)
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