Induktion der Autophagie durch EBSS

Nach erfolgreicher Infektion der Zellen, sollte nun im Folgenden untersucht werden, ob sich Unterschiede in der Bildung von LC 3-Punkten nach Autophagie-Induktion durch EBSS ergeben. Dafür wurden die mit den verschiedenen Konstrukten infizierten Zellen in drei unabhängigen Experimenten in LabTek®s ausgesät und für sechs Stunden, jeweils mit und ohne Zugabe von Inhibitoren, mit EBSS stimuliert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und mit einem spezifischen Antikörper gegen LC 3 und einem Fluoreszenz-markiertem Sekundärantikörper angefärbt. Durch Auszählung der LC 3-Punkte in den Zellen sollte die autophagische Aktivität der verschiedenen Zellinien analysiert werden. In Abbildung 3.1-17 ist die autophagische Aktivität unbehandelter Zellen dargestellt. Da die Zellen nicht zur Autophagie stimuliert wurden, zeigten die Zellen ein weitgehend homogen grün gefärbtes Zytoplasma mit vereinzelten LC 3-Punkten. Diese spiegelten die basale autophagische Aktivität der Zellen wieder. Morphologisch unterschieden sich auf den ersten Blick nur die Myc-Zellen von den Übrigen (Abb. 3.1-17c). Sie fielen durch einen vergleichsweise großen Zellkern und ein verbreitertes Zytoplasma, sowie seitliche Ausläufer, auf. Um die autophagische Aktivität dieser Zellen zu quantifizieren, wurden für jede Kondition die LC 3-Punkte pro Zelle in insgesamt 100 Zellen je Experiment ausgezählt.

71 Abbildung 3.1-17: Darstellung der autophagischen Aktivität in Zellen, die mit den Miz 1-, shMiz1-, Myc-, MycVD-, shScr- und pBABEpuro-Konstrukten infiziert wurden, nach Inkubation in Vollmedium. HC11-Zellen, die mit den dargestellten Konstrukten stabil infiziert waren, wurden in Lab-Tek®s für 6 h in normalem Medium ohne lysosomale Inhibitoren inkubiert (a - f). Die LC 3-Färbung erfolgte durch einen spezifischen Antikörper und einen fluorezenzmarkierten Sekundärantikörper (grün). Die Zellkerne wurden mit Hoechst 33258 gegengefärbt (blau). Die weißen Pfeile zeigen beispielhaft auf LC 3-Punkte. Die Pfeilspitze zeigt beispielhaft auf eine Myc-Zelle mit vergleichsweise großem Zellkern, verbreitertem Zytoplasma und Ausläufern (c).

In der Auszählung der LC 3-Punkte ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in den verschiedenen Zellen (siehe Abbildung 3.1-18). Die meiste autophagische Grundaktivität zeigten Zellen, die mit dem Myc-Konstrukt infiziert waren. In Zellen die MycVD überexprimierten, waren hingegen genauso viele LC 3-Punkte zu finden, wie in Kontrollzellen (pBABEpuro). Auch Zellen die Miz 1 überexprimierten zeigten eine leicht erhöhte basale autophagische Aktivität. Zwischen Zellen in

72 denen Miz 1 durch sh-RNA herunterreguliert war und den entsprechenden Kontrollzellen (ShScr) zeigten sich keine Unterschiede.

Abbildung 3.1-18: Quantifizierung der autophagischen Aktivität von Zellen, die mit den Miz 1-, shMiz1-, Myc-, MycVD-, shScr- und pBABEpuro-Konstrukten infiziert wurden, nach Inkubation in Vollmedium. In drei unabhängigen Experimenten wurden die in Abbildung 3.1-17 gezeigten LC 3-Punkte in je 100 Zellen pro Kondition ausgezählt. Dargestellt sind der Mittelwert und die Standartabweichung. Die Signifikanzen wurden beim Vergleich zweier Bedingungen (a + c), mittels Studenten-T-Test und beim Vergleich von mehr als zwei Bedingungen (b) mittles einfaktorieller ANOVA-Analyse mit anschließendem Bonferroni-Posttest ermittelt.

Weiterhin sollte untersucht werden, wie sich der Einsatz lysosomaler Inhibitoren auf die Anzahl von LC 3-Punkten bei sechsstündiger Inkubation in Vollmedium auswirkt (siehe Abb. 3.1-19). Da auch hier keine Autophagie induziert wurde, fand sich ebenfalls ein weitgehend homogen grünes Zytoplasma mit vereinzelten LC 3-Punkten. Auch hier fielen die langen Ausläufer der Myc-Zellen auf (Abb. 3.1-19c).

73 Abbildung 3.1-19: Darstellung der autophagischen Aktivität in Zellen, die mit den Miz -1, shMiz1-, Myc-, MycVD-, shScr- und pBABEpuro-Konstrukten infiziert wurden, nach Inkubation in Vollmedium mit Inhibitoren. HC11-Zellen, die mit den dargestellten Konstrukten stabil infiziert waren, wurden in Lab-Tek®s für 6 h in normalem Medium mit lysosomalen Inhibitoren (E-64d und Pepstatin A, je 10 µg/ml) inkubiert (a – f). Die LC 3-Färbung erfolgte durch einen spezifischen Antikörper und einen fluorezenzmarkierten Sekundärantikörper (grün). Die Zellkerne wurden mit Hoechst 33258 gegengefärbt (blau). Die weißen Pfeile zeigen beispielhaft auf LC 3-Punkte. Die Pfeilspitzen zeigen beispielhaft auf Myc-Zellen mit vergleichsweise großem Zellekern, verbreitertem Zytoplasma und Ausläufern (c).

In der Auszählung der LC 3-Punkte zeigten sich die gleichen Tendenzen wie in Zellen die nur mit Medium behandelt wurden. Auch hier fielen Zellen, die Myc überexprimierten und in geringerem Ausmaß auch Zellen, die Miz1 überexprimierten, durch eine verstärkte autophagische Aktivität im

74 Vergleich zu den übrigen Zelltypen auf. Die Inhibitoren zeigten unter diesen normalen Wachstumsbedingungen aber nur wenig Wirkung. Im Vergleich zu Zellen, in denen der lysosomale Abbau nicht gehemmt wurde, fand sich in den mit Inhibitoren behandelten Zellen durchschnittlich etwa ein Punkt mehr pro Zelle.

Abbildung 3.1-20: Quantifizierung der autophagischen Aktivität von Zellen, die mit den Miz 1-, shMiz1-, Myc-, MycVD-, shScr- und pBABEpuro-Konstrukten infiziert wurden, nach Inkubation in Vollmedium mit Inhibitoren. In drei unabhängigen Experimenten wurden die in Abbildung 3.1-19 gezeigten LC 3-Punkte in je 100 Zellen ausgezählt. Dargestellt sind der Mittelwert und die Standartabweichung. Die Signifikanzen wurden beim Vergleich zweier Bedingungen (a + c), mittels Studenten-T-Test und beim Vergleich von mehr als zwei Bedingungen (b) mittles einfaktorieller ANOVA-Analyse mit anschließendem Bonferroni-Posttest ermittelt.

In Zellen, in denen mit EBSS Autophagie stimuliert wurde, ließ sich unabhängig vom exprimierten Konstrukt, eine Zunahme der LC 3-Punkte im Vergleich zu Zellen, die in normalem Nährmedium wuchsen (siehe Abbildung 3.1-17, 3.1-18 und 3.1-21, 3.1-22), beobachten. Morphologisch fielen auch hier wieder die Zellen, die Myc überexprimierten, auf. Zum einen durch ihre wie bereits beschriebenen großen Zellkerne, das breite Zytoplasma und die Ausläufer, zum anderen schienen die LC 3-Punkte zahlreicher, aber dafür kleiner als in allen anderen Zelltypen. Zellen, die MycVD überexprimierten, unterschieden sich morphologisch nicht von Kontrollzellen.

In der Auszählung der LC 3-Punkte zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen den Zellen die Myc und denen die MycVD überexprimierten, sowie den Kontrollzellen (siehe Abbildung 3.1-22 b). In den Myc Zellen fanden sich durchschnittlich 10,65 Punkte pro Zelle, in den MycVD und den pBABEpuro-Zellen hingegen nur etwa 7 Punkte pro Zelle. Das weist darauf hin, dass die Interaktion von Myc und Miz 1 unter nährstoffarmen Bedingungen für den autophagischen Prozess wichtig sein könnte. Zellen, die Miz 1 überexprimierten, hatten tendenziell etwas mehr LC 3-Punkte, der Unterschied war im Vergleich zur entsprechenden Kontrolle aber nicht signifikant. Zwischen Zellen in denen Miz 1 supprimiert war und den entsprechenden Kontrollzellen fanden sich keine Unterschiede. Dieses

75 Ergebnis könnte allerdings auch auf den schwachen Miz 1-Knockdown zurückzuführen sein (siehe Abbildung 3.1-21 und 3.1-22).

Abbildung 3.1-21: Darstellung der autophagischen Aktivität in Zellen, die mit den Miz 1-, shMiz1-, Myc-, MycVD-, shScr- und pBABEpuro-Konstrukten infiziert wurden, nach Inkubation in EBSS. HC11-Zellen, die mit den dargestellten Konstrukten stabil infiziert waren, wurden in Lab-Tek®s für 6 h in EBSS ohne lysosomale Inhibitoren inkubiert (a – f). Die LC 3-Färbung erfolgte durch einen spezifischen Antikörper und einen fluorezenzmarkierten Sekundärantikörper (grün). Die Zellkerne wurden mit Hoechst 33258 gegengefärbt (blau).

Um den Effekt des EBSS durch eine Unterbrechung des autophagischen Flusses zu verstärken, wurden in einer weiteren Bedingung dem EBSS noch lysosomale Inhibitoren hinzugefügt. Auch in dieser Bedingung ließ sich in allen veschiedenen Zelltypen Autophagie stimulieren und sie zeigten mehr LC

3-76 Punkte als Zellen, die in Medium (mit oder ohne Inhibitoren) gewachsen waren (vergleiche Abb. 3.1-23 mit Abb. 3.1-17 und Abb. 3.1-19).

Abbildung 3.1-22: Quantifizierung der autophagischen Aktivität von Zellen, die mit den Miz 1-, shMiz1-, Myc-, MycVD-, shScr- und pBABEpuro-Konstrukten infiziert wurden, nach Inkubation in EBSS. In drei unabhängigen Experimenten wurden die in Abbildung 3.3-21 gezeigten LC 3-Punkte in je 100 Zellen ausgezählt. Dargestellt sind der Mittelwert und die Standartabweichung. Die Signifikanzen wurden beim Vergleich zweier Bedingungen (a + c), mittels Studenten-T-Test und beim Vergleich von mehr als zwei Bedingungen (b) mittles einfaktorieller ANOVA-Analyse mit anschließendem Bonferroni-Posttest ermittelt. Signifikante Unterschiede wurden mit Sternen markiert. ***:p<0,001, **:p<0,01, *:p<0,05.

Die Myc-Zellen unterschieden sich durch die Zugabe der Inhibitoren noch deutlicher von den anderen Zellen, da hier die LC 3-Punkte sehr zahlreich und vergleichsweise klein vorhanden waren (siehe Abb.

3.1-23 c). Große Zellkerne und Zytoplasma-Ausläufer ließen sich auch hier finden. Die MycVD-Zellen glichen auch hier eher den Kontrollzellen, als denen, die Myc überexprimierten (siehe Abb. 3.1-23 d).

Durch die Zugabe der lysosomalen Inhibitoren wurden die Unterschiede in der Quantifizierung der autophagischen Aktivität noch etwas deutlicher (siehe Abb. 3.1-24). Zellen, die Myc überexprimierten, zeigten im Durchschnitt 16.22 Punkte und unterschieden sich somit signifikant von MycVD-Zellen mit 9.24 und Kontrollzellen mit durchschnittlich 7.73 Punkte pro Zelle (siehe Abb. 3.1-24 b). Der Unterschied zwischen MycVD und der Kontrolle war nicht signifikant. Diese Beobachtung unterstreicht die Annahme, dass die Interaktion von Miz 1 und Myc für Autophagie eine Rolle spielen könnte. Ob diese Interaktion allerdings essentiell für den autophagischen Prozess ist, lässt sich aus diesen Experimenten nicht ableiten, da die Zellen, die MycVD überexprimierten, auch noch endogenes Myc produzierten, das durchaus an Miz 1 binden kann. Auch der leichte Unterschied zwischen Zellen die Miz 1 überexprimierten (8.81 Punkte pro Zelle, siehe Abb. 3.1-24 a) und den entsprechenden Kontrollzellen, der sich in den vorherigen Bedingungen bereits angedeutet hatte, hat sich durch die Zugabe der Inhibitoren verstärkt und wurde statistisch signifikant. Zwischen den Miz

1-77 Knockdown-Zellen und der Kontrolle ergaben sich wiederum keine Unterschiede (siehe Abbildung 3.1-24 c).

Abbildung 3.1-23: Darstellung der autophagischen Aktivität in Zellen, die mit den Miz 1-, shMiz1-, Myc-, MycVD-, shScr- und pBABEpuro-Konstrukten infiziert wurden, nach Inkubation in EBSS mit Inhibitoren. HC11-Zellen, die mit den dargestellten Konstrukten stabil infiziert waren, wurden in Lab-Tek®s für 6 h in EBSS mit lysosomalen Inhibitoren (E-64d und Pepstatin A, je 10 µg/ml) inkubiert (a – f). Die LC 3-Färbung erfolgte durch einen spezifischen Antikörper und einen fluorezenzmarkierten Sekundärantikörper (grün). Die Zellkerne wurden mit Hoechst 33258 gegengefärbt (blau). Die weißen Pfeile zeigen beispielhaft auf LC 3-Punkte. Die Pfeilspitzen zeigen beispielhaft auf Myc-Zellen mit vergleichsweise großem Zellekern, verbreitertem Zytoplasma und Ausläufern (c).

78 Abbildung 3.1-24: Quantifizierung der autophagischen Aktivität von Zellen, die mit den Miz 1-, shMiz1-, Myc-, MycVD-, shScr- und pBABEpuro-Konstrukten infiziert wurden, nach Inkubation in EBSS mit Inhibitoren. In drei unabhängigen Experimenten wurden die in Abbildung 3.1-23 gezeigten LC 3-Punkte in je 100 Zellen ausgezählt.

Dargestellt sind der Mittelwert und die Standartabweichung. Die Signifikanzen wurden beim Vergleich zweier Bedingungen (a + c), mittels Studenten-T-Test und beim Vergleich von mehr als zwei Bedingungen (b) mittles einfaktorieller ANOVA-Analyse mit anschließendem Bonferroni-Posttest ermittelt. Signifikante Unterschiede wurden mit Sternen markiert. ***:p<0,001, **:p<0,01, *:p<0,05.

3.1.6 Elektronenmikroskopische Analyse von Myc bzw. MycVD überexprimierenden