In-Gel Proteinfärbungen

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Für die Färbelösung wird zuerst der Coomassie-Farbstoff in Methanol und das Kupfersulfat in der Essigsäure gelöst, anschließend werden beide Lösungen mit Wasser auf das halbe Endvolumen aufgefüllt und im Verhältnis 1 zu 1 gemischt.

Gele werden zur Färbung für etwa eine halbe Stunde in der Färbelösung unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend werden sie so lange in der Entfärbelösung geschüttelt, bis der Hintergrund annähernd klar ist. Färbung sowie Entfärbung können wiederholt werden.

4.10.2 Roti

Blue Färbung

Die Roti^® Blue Färbung ist eine kolloidale Coomassie Färbung, die laut Hersteller eine Sensitivität von 30 ng pro Bande erreichen kann. Sie liegt somit im Bereich der Silberfärbung nach Blum. In dieser Arbeit wird sie hauptsächlich bei Gelen verwendet, die geblottet wurden, um die Transfereffizienz zu überprüfen, sowie für verschiedene Gelsorten der ersten Dimension.

Färbelösung Roti^® Blue 10fach Konzentrat 20% (v/v)

Methanol, technisch 20% (v/v)

Entfärbelösung Methanol, technisch 25% (v/v)

Beide Lösungen werden mit bidest H2O angesetzt. Das Gel wird in der Färbelösung mindestens 2 Stunden oder länger, bis zu 15 Stunden, unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wird es in der Entfärbelösung so lange gewaschen, bis der Hintergrund klar ist.

4.10.3 Silbernitrat Färbung

Die Silbernitrat Färbung nach Blum (Blum et al., 1987; Rabilloud et al., 1988) ist eine Färbung, die mit einer anschließenden MALDI-Analyse kompatibel ist. Die Sensitivität liegt bei 5 bis 30 ng Protein pro Bande, ist also relativ hoch. Der dynamische Bereich ist mit nur einer Größenordnung relativ klein, daher wird die Färbung nicht für quantitative Analysen eingesetzt.

Das zu färbende Gel wird zweimal 30 Minuten in Fixierer 1 und anschließend dreimal 20 Minuten in Fixierer 2 inkubiert. Dem Gel wird dadurch Wasser entzogen und es

59 wird kleiner. Nach dem Fixieren wird das Gel für etwa eine Minute in den Sensitivierer gelegt, bis es seine ursprüngliche Größe wieder angenommen hat, und anschließend gründlich mit Wasser gewaschen. Das Gel wird in die Silbernitratlösung gelegt und 20 Minuten leicht geschüttelt. Nachdem Reste der Silbernitratlösung sorgfältig abgespült wurden, wird das Gel in der Entwicklerlösung solange inkubiert, bis die bräunliche Färbung die gewünschte Intensität erreicht hat. Der Färbeprozess wird durch die Stopplösung angehalten. Das Gel kann anschließend in wenig Lagerlösung aufbewahrt werden.

Fixierer 1 Methanol, technisch 50% (v/v)

Essigsäure 12% (v/v)

Fixierer 2 Ethanol, technisch 50% (v/v)

Sensitivierer Natriumthiosulfat 0,81 mM

Silberlösung Silbernitrat 11,77 mM

Formaldehyd 0,0263% (v/v)

Entwicklerlösung Natriumcarbonat 566,1 mM

Natriumthiosulfat 0,02 mM

Formaldehyd 0,0175% (v/v)

Stopplösung Essigsäure 10% (v/v)

Lagerlösung Essigsäure 1% (v/v)

Es wird grundsätzlich bidest. H₂O oder eine bessere Qualität verwendet.

4.10.4 SYPRO

Ruby Färbung

Diese Fluoreszenzfärbung ist hoch sensitiv und quantitativ, sie wird bei Gelen der zweiten Dimension zur vergleichenden quantitativen Analyse eingesetzt. Die Methode wird eingehend beschrieben in Kapitel 2.1.1 der Einleitung.

Fixierer Methanol, technisch 10% (v/v)

Essigsäure 7% (v/v)

Färbelösung SYPRO^® Ruby unverdünnt

Waschlösung Methanol, technisch 10% (v/v)

Essigsäure 7% (v/v)

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Das Gel wird zuerst für mindestens drei Stunden fixiert und anschließend in die Färbelösung gegeben. Der Fluoreszenzfarbstoff ist nicht lichtstabil und bleicht relativ schnell aus, aus diesem Grund findet der drei- bis vierstündige Färbeprozess sowie die weitere Behandlung des gefärbten Gels unter Lichtausschluss statt. Nach dem Färben wird das Gel zehn Minuten lang in der Waschlösung entfärbt. Vor der Fluoreszenzdetektion wird das Gel mit bidest. H2O abgespült. Die Detektion erfolgt in der LAS-3000 bei einer Anregungswellenlänge von 460 nm (blaue LEDs) und einem LP Filter ab 605 nm.

4.10.5 Pro-Q

Diamond Färbung

Ähnlich wie SYPRO^® Ruby ist auch Pro-Q^® Diamond ein Fluoreszenzfarbstoff. Er soll laut Hersteller spezifisch an phosphorylierte Proteine binden und es so ermöglichen, alle Phosphoproteine in einem 2D Gel oder auf einer Westernblotmembran auf einmal zu markieren. Hierbei soll die Nachweisgrenze bei 8 bis 16 ng pro Bande liegen. Um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden, muss zum Vergleich immer noch ein Bild des gleichen Gels oder Blots, diesmal mit SYPRO^® Ruby gefärbt, aufgenommen werden.

Proteine, die im Verhältnis mit Pro-Q^® Diamond stärker angefärbt werden als mit SYPRO^® Ruby, sind Phosphoproteine.

Ein Gel wird zunächst mindestens zweimal 30 Minuten lang unter leichtem Schütteln in Fixierer inkubiert und anschließend dreimal für zehn Minuten mit Wasser gewaschen. Für die Färbung selbst wird das Gel für 90 Minuten in die unverdünnte Färbelösung gelegt und wiederum leicht geschüttelt. Ab jetzt müssen alle weiteren Schritte unter Abdunklung erfolgen, da der Farbstoff nicht lichtstabil ist. Das Gel wird dreimal für 30 Minuten mit der Waschlösung entfärbt. Nach zweimaligem kurzen Waschen mit Wasser wird die Fluoreszenz im LAS-3000 bei 520 nm (grüne Dioden) angeregt und mit einem LP 575 Filter detektiert.

Eine Westernblot Membran wird mit Methanol benetzt und mit der Proteinseite nach unten für zehn Minuten in den Fixierer gelegt. Anschließend wird sie viermal für einige Minuten in Wasser gewaschen. Es folgt eine 15 minütige Inkubation unter

61 leichtem Schütteln in der Färbelösung. Nachdem überschüssiger Farbstoff dreimal für einige Minuten mit der Waschlösung abgespült wurde, wird die Membran zur Detektion getrocknet. Diese erfolgt in der LAS-3000 nach einer Fluoreszenzanregung bei 520 nm (grüne Dioden) mit einem LP 575 Filter.

Beide Methoden erfordern es, das Gel/den Blot entweder gar nicht oder mit einer Pinzette anzufassen. Ansonsten besteht die Gefahr, dass sich auch die angefassten Stellen färben.

Fixierer Gel Methanol, technisch 50% (v/v)

Essigsäure 10% (v/v)

Färbelösung Gel Pro-Q^® Diamond Gel Stain unverdünnt

Fixierer Blot Methanol, technisch 10% (v/v)

Essigsäure 7% (v/v)

Färbelösung Blot Pro-Q^® Diamond Blot Stain Komponente A

0,1% (v/v)

Pro-Q^® Diamond Blot Stain Komponente B

auffüllen

Waschlösung Natriumacetat 50 mM

Acetonitril 20% (v/v)

Der pH Wert wird mit Essigsäure auf 4,0 eingestellt.