Immunozytochemie von Parkin und BAG1 in CSM14.1-Zellen

In einem zweiten Ansatz sollte eine Co-Lokalisation von Parkin und BAG1 mit Hilfe von Immunozytochemie-Versuchen in der Zelle dargestellt werden. Durch fluoreszierende Signalpeptide, wie beispielsweise dem GFP-tag, oder durch fluoreszierende Antikörper können Proteine in der Zelle und durch die Überlagerung der Farbsignale auch Interaktionen sichtbar gemacht werden. Für die Versuche wurden CSM14.1-Zellen verwendet.

Überexpression von Parkin

Zunächst erfolgte eine alleinige Überexpression von Parkin. Hierbei zeigte sich eine homogene Verteilung des Parkin-Farbsignals im gesamten Zytoplasma (s. Abb. 3.3 A-C).

In einigen Zellen wurden mehrere kleine zytoplasmatische Aggregate detektiert, andere zeigten perinukleäre Akkumulationen von Parkin (s. Abb. 3.3 D-F). Diese Aggregation konnte sowohl bei einer Überexpression von GFP-Parkin, als auch von Wildtyp-Parkin (wt-Parkin) mit Anfärbung über fluoreszierende Antikörper dargestellt werden (Daten nicht gezeigt). Daher kann davon ausgegangen werden, dass die Akkumulation nicht auf das GFP-Signalpetid zurückzuführen ist.

Abb. 3.3: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (63x Objektiv) nach Überexpression von GFP-Parkin und pcDNA-LV in CSM14.1-Zellen. Obere Reihe (A-C): Homogene Verteilung von GFP-Parkin im Zytoplasma. Untere Reihe (D-F): Akkumulation von GFP-Parkin in zytoplasmatische Aggregate bei Überexpression. A: GFP-Parkin; B: DAPI; C: Überlagerung; D: GFP-Parkin; E: DAPI; F: Überlagerung.

A B C

D E F

10 µm 10 µm 10 µm

10 µm 10 µm 10 µm

43 Überexpression von BAG1

Bei der Überexpression von GFP-BAG1 in CSM14.1-Zellen zeigte sich, wie in der Literatur beschrieben (Kermer et al. 2002), eine homogene Verteilung im Zytoplasma sowie eine kräftige Anreicherung von BAG1 im Nukleus (Daten nicht gezeigt).

Überexpression von Parkin und GFP-BAG1

Zur Darstellung einer Co-Lokalisation beider Proteine wurden Parkin und GFP-BAG1 in CSM14.1-Zellen überexprimiert. GFP-BAG1 zeigt, wie auch schon bei der alleinigen Überexpression, eine zytoplasmatische und nukleäre Lokalisation (s. Abb. 3.4 A). Parkin konnte vor allem im Zytoplasma angefärbt werden (s. Abb. 3.4 B).

Eine Überlagerung der Farbsignale von GFP-BAG1 (grün) mit Parkin (rot) und damit eine mutmaßliche Co-Lokalisation der beiden Proteine konnte in allen doppelt transfizierten Zellen nachgewiesen werden. Diese Co-Lokalisation lies sich vorallem im Zytoplasma darstellen (s.

Abb. 3.4 D). Auch bei der Co-Expression von Parkin mit GFP-BAG1 wurden die schon bei alleiniger Parkin-Überexpression beschriebenen Aggregate in einigen Zellen beobachtet (Daten nicht gezeigt).

Abb. 3.4: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (63x Objektiv) nach Überexpression von Parkin und GFP-BAG1 in CSM14.1-Zellen. Parkin wurde mit einem Cy3-gekoppelten Antikörper gefärbt. A: GFP-BAG1;

B: Parkin; C: DAPI; D: Überlagerung.

A B

D C

10 µm 10 µm

10 µm 10 µm

44 Überexpression von Parkin und GFP-BAG∆C

Da bereits in Co-Immunopräzipitations-Versuchen eine Interaktion von Parkin und BAG∆C nachgewiesen werden konnten, sollte diese Bindung bestätigend in Immunozytochemie-Versuchen dargestellt werden. Bei der Überexpression von Parkin und GFP-BAG∆C in CSM14.1-Zellen zeigte sich, wie schon zuvor bei BAG1, eine Übereinstimmung der Lokalisation von Parkin und BAG∆C im Zytoplasma der Zelle (s. Abb. 3.5 D).

Durch die Deletionsmutation am C-Terminus des Proteins verliert BAG∆C, wie bereits berichtet (Liman et al. 2005), die nukleäre Lokalisation und ist nur zytoplasmatisch nachweisbar (s. Abb. 3.5 A).

Abb. 3.5: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (63x Objektiv) nach Überexpression von Parkin und BAG∆C in CSM14.1-Zellen. Parkin wurde mit einem Cy3-gekoppelten Antikörper gefärbt. A: GFP-BAG∆C, B: Parkin, C: DAPI, D: Überlagerung.

Mit den Immunozytochemie-Versuchen wurde gezeigt, dass Parkin, BAG1 sowie BAG∆C zytoplasmatische Proteine sind. BAG1 konnte zudem nukleär lokalisiert werden. Parkin, BAG1 sowie BAG∆C verteilen sich homogen im Zytoplasma, wobei Parkin bei Überexpression in einigen Zellen zu zytoplasmatischen Aggregaten akkumuliert. Eine Co-Lokalisation zwischen Parkin und BAG1 ebenso mit BAG∆C konnte im Zytoplasma immunzytochemisch bestätigt werden.

A B

C D

10 µm 10 µm

10 µm 10 µm

45

3.2. Kartierung der interagierenden Domäne unter Verwendung verschiedener Parkin- Deletionsmutanten

Um die für die Interaktion mit BAG1 relevante Parkin-Domäne zu identifizieren, wurden verschiedene FLAG-Parkin-Deletionsmutanten kloniert und im Anschluss für Co-Immunopräzipitations-Versuche mit BAG1 überexprimiert.

3.2.1 Parkin-Deletionsmutations-Konstrukte

Für ein direktes „mapping“ der interagierenden Domäne wurden zunächst die mit einem FLAG-tag versehenen Parkin-Deletionsmutanten FLAG-∆UBL (AS 77- 465), FLAG-∆Linker (AS 217- 465), FLAG-∆Ring1 (AS 304- 465) und FLAG-∆IBR (AS 395- 465) kloniert. Wie in Abbildung 3.6 zu sehen ist, fehlt der ∆UBL-Mutante die Ubiquitin-like-Domäne, der

∆Linker-Mutante zusätzlich Teile der Linker-Region und der ∆Ring1-Mutante des Weiteren die erste Ring-Domäne. Die ∆IBR-Mutante besteht funktionell nur noch aus dem zweiten Ring der Ring-IBR-Ring-Domäne. Alle Parkin-Fragmente wurden in den Vektor pcDNA3.1 kloniert. Als Matrize diente pcDNA-FLAG-Parkin, das für humanes wt-Parkin kodiert. Die N-terminalen Deletionsmutanten wurden ausgehend von pcDNA-FLAG-Parkin-Plasmid mit dem jeweiligen EcoRI-Forward- und dem NotI-Backward-Primer amplifiziert. Über die Schnittstellen der Restrikionsendonukleasen EcoRI und NotI wurde das Produkt in das Plasmid pcDNA3.1 ligiert.

Abb. 3.6: Schematische Darstellung der klonierten Parkin-Deletionsmutantions-Konstrukte. Zusätzlich ist noch wt-Parkin ohne Signalpeptid abgebildet.

46

3.2.2 Restriktionsenzymverdau der Parkin-Deletionsmutanten

Zur Kontrolle der korrekten Ligatur der Parkin-Deletionsmutanten wurden die Inserts nach einer Mini-Präparation durch die Restriktionsendonukleasen EcoRI und NotI aus dem Vektor herausgeschnitten. Die folgende Abbildung zeigt den Verdau der vier Parkin-Deletionsmutanten und des wt-Parkin. Aufgrund der geringen Größe und der damit verbundenen schnelleren Laufgeschwindigkeit im Gel, konnte die ∆IBR-Mutante bei normaler Belichtungszeit nicht detektiert werden. Eine längere Belichtungszeit bestätigte aber die Anwesenheit des DNA-Fragments (s. Abb. 3.7 rechts). Die dargestellten DNA-Banden weisen alle die jeweils berechnete korrekte Größe in Basenpaaren (bp) auf.

Abb. 3.7: Restriktionsenzymverdau der Parkin-Deletionsmutanten.Links: Normale Belichtungszeit; Rechts:

verlängerte Belichtungszeit zur Darstellung der ∆IBR-Mutante. 1: wt-Parkin; 2: FLAG-∆UBL-Mutante; 3:

FLAG-∆Linker-Mutante; 4: FLAG-∆Ring1-Mutante; 5: FLAG-∆IBR-Mutante.

3.2.3 Sequenzierung der Parkin-Deletionsmutanten

Die durch die Sequenzierung erhaltende Basenfolge wurde manuell mit der bekannten zugehörigen Parkin-Sequenz verglichen. Bei allen Parkin-Deletionsmutanten konnten ungewollte Punkt- und Rastermutationen ausgeschlossen werden, da die Basenfolgen vollständig mit der zugehörigen Parkin-Sequenz übereinstimmten.

3.2.4 Überexpression der Deletionsmutanten in HEK293- und CSM14.1-Zellen

Nach erfolgreicher Klonierung wurden die Parkin-Deletionsmutanten zunächst in HEK293- und CSM14.1-Zellen überexprimiert. Die folgende Abbildung zeigt die Transfektion der Parkin-Deletionsmutanten in HEK293-Zellen. Bis auf das FLAG-∆IBR-Deletionskonstrukt konnten alle Mutanten erfolgreich in beiden Zelllinien exprimiert und dargestellt werden.

Eine Transfektion mit pcDNA-LV diente als Negativkontrolle.

1 2 3 4 5 bp

1500

1000 750 500 250

1 2 3 4 5

47

Als Grund für die erfolglose Expression des FLAG-∆IBR-Konstruktes wurde eine erhöhte Abbaurate, zusammenhängend mit der geringen Größe der Mutante, vermutet.

Abb. 3.8: Immunoblot nach Überexpression der Parkin-Deletionsmutanten in HEK293-Zellen. Beim Western Blot wurde Parkin detektiert. 1: FLAG-Parkin; 2: FLAG-∆UBL-Mutante; 3: FLAG-∆Linker-Mutante;

4: FLAG-∆Ring1-Mutante; 5: FLAG-∆IBR-Mutante; 6: wt-Parkin; 7: pcDNA-LV.

3.2.5 Kartierungsexperimente unter Verwendung der Parkin-Deletionsmutanten und BAG1

Zur Kartierung der interagierenden Domäne wurden die vier FLAG-Parkin-Deletionsmutanten in HEK293-Zellen zusammen mit BAG1 überexprimiert. Als Negativkontrolle diente die Co-Transfektion von BAG1 mit pcDNA-LV. Zur Positivkontrolle wurde FLAG-wt-Parkin zusammen mit BAG1 überexprimiert. Die Präzipitation erfolgte mittels FLAG-Beads wie bereits in Kap. 3.1.1 beschrieben. Im Anschluss wurde im Western Blot gegen BAG1 detektiert.

Wie in Abbildung 3.9 zu sehen ist, lässt sich eine Interaktion zwischen der FLAG-∆UBL-, der FLAG-∆Linker- sowie der FLAG-∆Ring1-Mutante mit BAG1 darstellen. Bei diesen Konditionen konnte ein spezifisches positives BAG1-Signal im Western Blot, vergleichbar mit der Positivkontrolle, detektiert werden. Bei der Co-Expression derFLAG-∆IBR-Mutante mit BAG1 konnte dagegen kein BAG1-Signal dargestellt werden.

Da schon in der oben beschriebenen Expressionskontrolle diese Mutante nicht darstellbar war, kann davon ausgegangen werden, dass das fehlende BAG1-Signal hierauf zurückzuführen ist.

1 2 3 4 5 6 7

kDa

55 43 34

17

48

Auf eine fehlende Interaktion der beiden Proteine kann jedoch nicht geschlossen werden. Die in Abbildung 3.9 dargestellten Ergebnisse konnten auch in der neuronalen Zelllinie CSM14.1 erzielt werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 3.9: Immunoblot nach Überexpression der Parkin-Deletionsmutanten mit BAG1 in HEK293-Zellen. Die überexprimierten Parkin-Deletionsmutanten wurden über FLAG-Beads präzipiert. Anschließend wurde im Western Blot BAG1 detektiert (oben). Zur Kontrolle der Expression wurden das Voll-Lysat (Input) mit Parkin-, BAG1- und Aktin-Antikörpern analysiert (unten). 1: FLAG-wt-Parkin+BAG1; 2: FLAG-∆UBL-Mutante+BAG1; 3: FLAG-∆Linker-FLAG-∆UBL-Mutante+BAG1; 4: FLAG-∆Ring1-FLAG-∆UBL-Mutante+BAG1; 5: FLAG-∆IBR-Mutante+BAG1; 6: BAG1+pcDNA-LV.

1 2 3 4 5 6

kDa

IP: α-FLAG WB: α- BAG1

Input: α-Parkin

Input: α-BAG1

Input: α-Aktin 26

55

26

26

55

49

3.3 Funktionelle Untersuchungen der E3-Ligase-Funktion von Parkin

Parkin ist mit seiner E3-Ligase-Funktion Teil des UPS. Über die Ubiquitinylierung von Substratproteinen führt Parkin diese dem Abbau durch das Proteasom zu. Über die Ubiquitinylierung von CDCrel-1, eines der Substratproteine, oder dessen beschleunigte Abbaurate lässt sich die E3-Ligase-Aktivität untersuchen.

3.3.1 Degradationszeitreihen unter Verwendung von Cycloheximid als Translations-Inhibitor

Um den Einfluss von BAG1 auf die E3-Ligase-Funktion von Parkin zu erfassen, sollte zunächst die Abbaurate des Substratproteins CDCrel-1 untersucht werden.

Hierfür wurden CSM14.1-Zellen mit HA-CDCrel-1, Parkin, BAG1 und BAG∆C transfiziert und 17 Std später mit dem Antibiotikum Cycloheximid behandelt, wodurch über die Inhibition der Proteinbiosynthese die Halbwertszeit von Proteinen bestimmt werden kann. Die CSM14.1-Zellen wurden für 0, 1,5, 3, 6 und 9 Std mit dem Antibiotikum inkubiert und im Anschluss mittels Western Blot analysiert.

Abbildung 3.10 zeigt die zeitliche Verminderung der HA-CDCrel-1-Proteinkonzentration in den verschiedenen Konditionen.

Bei einer Co-Expression von CDCrel-1 mit Parkin lässt sich ein verminderter HA-CDCrel-1-Proteingehalt, vorallem bei einer Inkubationszeit von 6 und 9 Std, im Vergleich zur Negativkontrolle (HA-CDCrel-1+pcDNA-LV) darstellen. Die Co-Transfektion des Substratproteins mit BAG1, BAG∆C oder Parkin und BAG1 bzw. BAG∆C ergab dagegen Proteinlevel vergleichbar mit der Negativkontrolle.

Zur Sicherstellung vergleichbarer Proteinmengen wurde sowohl eine Konzentrationsbestimmung mittels eines BCA-Assays durchgeführt als auch im Anschluss an den Western Blot die Menge an Aktin als Kontrollprotein detektiert. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde jedoch auf die Darstellung der Aktinkontrolle in Abbildung 3.10 verzichtet.

50

Abb. 3.10: Immunoblot der Halbwertszeit des Substratproteins HA-CDCrel-1. CSM14.1-Zellen wurden mit HA-CDCrel-1 und Parkin, BAG1 bzw. BAG∆C überexprimiert, 17 Std nach der Transfektion mit 20 µg/ml Cycloheximid behandelt und für 0, 1,5, 3, 6 und 9 Std inkubiert. Im Western Blot wurde gegen CDCrel-1 detektiert.

3.3.2 Die Parkin-vermittelte Ubiquitinylierung des Substratproteins CDCrel-1

Die oben beschriebenen Beobachtungen der Cycloheximid-Experimente wurden in einem zweiten experimentellen Ansatz verifiziert. Hierbei wurde die Parkin-vermittelte Ubiquitinylierung des Substratproteins CDCrel-1 in An- bzw. Abwesenheit von BAG1 und BAGC im Western Blot untersucht.

CSM14.1-Zellen wurden mit HA-CDCrel-1, Parkin, BAG1 und BAGC überexprimiert und 12 Std nach der Transfektion mit dem Proteasom-Inhibitor MG 132 für weitere 12 Std inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Präzipitation des Substratproteins mit Hilfe eines gegen den HA-tag gerichteten Antikörpers. Durch die Hemmung des proteasomalen Abbaus akkumulieren ubiquitinylierte Proteine in der Zelle. Diese können als hochmolekulare Banden im Western Blot als sogenannte „Ubiquitin-Leiter“ oder „Ubiquitin-smear“ nachgewiesen werden.

Bei der Untersuchung des hochmolekularen, ubiquitinylierten CDCrel-1-Anteils wurden verschiedene Ubiquitin-Antikörper verwendet. Da jedoch alle verwendeten Antikörper ein

0 1,5 3 6 9

HA-CDCrel-1+ pcDNA-LV

HA-CDCrel-1+Parkin

HA-CDCrel-1+ Parkin+BAG1

HA-CDCrel-1+BAG1

HA-CDCrel-1+ Parkin+BAG∆C

HA-CDCrel-1+ BAG∆C Inkubationszeit (Std)

kDa 55

55

55

55

55

55

51

hohes Maß an unspezifischen Bindungen aufwiesen, wurde in der folgenden Abbildung ein spezifischer CDCrel-1 Antikörper verwendet. Die hochmolekularen Banden zeigten eine Übereinstimmung bei beiden Analysen, sodass davon ausgegangen werden kann, dass diese Banden den ubiquitinylierten CDCrel-1 entsprechen.

Bei der Präzipitation kam es zu einer Überlagerung der HA-CDCrel-1 Bande mit der schweren Kette des Antikörpers (s. Abb. 3.11 oben). Bei diesem Versuch sollten jedoch nur die höhermolekularen, ubiquitinylierten Proteinanteile berücksichtigt werden.

Der hochmolekulare Anteil des Proteins HA-CDCrel-1 und damit der Anteil des ubiquitinylierten Proteins ist quantitativ am stärksten bei der Co-Transfektion von HA-CDCrel-1 und Parkin ausgeprägt (s. Abb. 3.11 oben). Auch diese Beobachtung bestätigt, dass CDCrel-1 ein Parkin-Substratprotein ist und durch dieses ubiquitinyliert sowie seinem Abbau zugeführt wird.

Sowohl die Co-Expression von HA-CDCrel-1 mit BAG1, Parkin und BAG1, Parkin und BAGC, als auch die alleinige Co-Transfektion mit BAGC entsprechen quantitativ der Kontrollbedingung, d.h. einer Überexpression des Substratproteins mit pcDNA-LV.

Es kann daher davon ausgegangen werden, dass BAG1 einen inhibierenden Einfluss auf die E3-Ligase-Funktion von Parkin hat, da hier der Anteil des ubiquitinylierten Substratproteins vermindert ist. Die Deletionsmutante des BAG1, BAG∆C, übt den gleichen hemmenden Effekt auf Parkin aus.

Die in Abbildung 3.11 dargestellte verminderte Parkin-vermittelte Ubiquitinylierung des Substratproteins CDCrel-1 bei Anwesenheit von BAG1 und BAG∆C sind somit kongruent mit den in Kapitel 3.3.1 gezeigten Ergebnissen.

52

Abb. 3.11: Immunoblot der Ubiquitinylierung des Substratproteins HA-CDCrel-1. CSM14.1-Zellen wurden transient mit CDCrel-1, Parkin, BAG1 sowie BAG∆C transfiziert. CDCrel-1 wurde über HA-Beads präzipiert und anschließend im Western Blot über α-CDCrel-1 detektiert (oben). Zur Kontrolle wurde das Voll-Lysat (Input) mit CDCrel-1, Parkin-, BAG1- und Aktin-Antikörper analysiert (unten). 1: CDCrel-1+pcDNA-LV; 2: CDCrel-1+Parkin; 3: CDCrel-1+Parkin+BAG1; 4: CDCrel-1+BAG1; 5: HA-CDCrel-1+Parkin+BAG∆C; 6: HA-CDCrel-1+ BAG∆C.

Mit diesen beiden Experimenten konnte gezeigt werden, dass BAG1 und auch die Deletionsmutante BAG∆C einen inhibierenden Einfluss auf die E3-Ligase-Funktion von Parkin zu haben scheint. Sowohl die Abbaurate, als auch die Parkin-vermittelte Ubiquitinylierung des Substratproteins CDCrel-1 waren bei einer Co-Expression mit BAG1 oder BAG∆C vermindert.

55

kDa 1 2 3 4 5 6

Schwere Ketten

Leichte Ketten 55

95

Input: α-CDCrel-1

Input: α-Parkin

Input: α-BAG1

Input: α-Aktin IP: α-HA

WB: α-CDCrel-1

55

26

43

53

3.4 Der Einfluss von BAG1 auf die Lokalisation und Löslichkeit von Parkin 3.4.1. Untersuchung zur subzellulären Lokalisation von Parkin

Als nächstes sollte die subzelluläre Verteilung von Parkin und die Einflussnahme von BAG1 bzw. BAG∆C mittels Western Blot untersucht werden. Durch eine fraktionierte Lyse von SH-SY5Y-Zellen mit vier unterschiedlichen Puffern erfolgte eine Aufteilung der Proteine in Zytoplasma, Membran und Zellorganellen, Nukleus sowie Zytoskelett. Die erfolgreiche Fraktionierung wurde durch die Detektion spezifischer Proteine der einzelnen Kompartimente belegt (s. Abb. 3.12 A und B unten).

Parkin konnte in den Fraktionen Zytoplasma, Membran und Organellen, sowie Zytoskelett sowohl in An-, als auch in Abwesenheit von BAG1 bzw. BAG∆C detektiert werden. Im nukleären Kompartiment konnte Parkin in keiner der Konditionen dargestellt werden (s. Abb.

3.12 A). Auffällig ist jedoch, dass bei der Co-Expression mit BAG1, Parkin deutlich reduziert in allen oben genannten Fraktionen nachweisbar war. Die gleichzeitige Überexpression mit BAG∆C ergab in der zytoplasmatischen und membranösen Fraktion ein ähnliches Verteilungsmuster zur alleinigen Parkin-Expression. Im zytoskelettalen Kompartiment konnte Parkin jedoch auch hier deutlich vermindert nachgewiesen werden (s. Abb. 3.12 A).

Die subzelluläre Lokalisation von Parkin sollte in einem zweiten Ansatz unter Inhibition des Proteasoms untersucht werden. Hierfür wurden die SH-SY5Y-Zellen zusätzlich mit MG 132 für 12 Std inkubiert.

Bei diesem Versuch konnte Parkin in allen vier Kompartimenten, also auch der nukleären Fraktion nachgewiesen werden. Die oben beschriebene Beobachtung eines verminderten Parkin-Proteinlevels bei der Co-Expression mit BAG1 konnte auch bei der Inhibition des Proteasoms mit MG 132 beobachtet werden (s. Abb. 3.12 B). Am stärksten wurde dieser Unterschied in der Fraktion des Zytoskeletts sichtbar. Hier wurde vor allem der hochmolekulare Anteil von Parkin vermindert detektiert.

Bei der Co-Expression mit BAG∆C zeigte sich in den Fraktionen Zytoplasma, Membran und Organellen, sowie Nukleus eine annähernd gleich starke Parkin-Verteilung vergleichbar mit der alleinigen Expression von Parkin. Lediglich im zytoskelettalen Kompartiment konnten die hochmolekularen Anteile von Parkin vermindert nachgewiesen werden (s. Abb. 3.12 B). Dies entspricht der Verteilung ohne den Proteasom-Inhibitor.

Zusammenfassend konnte Parkin bei einer Co-Expression mit BAG1 in allen zellulären Kompartimenten vermindert nachgewiesen werden. Vorallem in der zytoskelettalen Fraktion wurde ein geringerer Anteil des hochmolekularen, ubiquitinylierten Parkins detektiert. Im

54

nukleären Kompartiment kam Parkin nur nach vorheriger Inhibition des Proteasoms zur Darstellung.

Als Ursache für die geringere Nachweisbarkeit wurden Änderungen in der Halbwertszeit und Löslichkeit von Parkin vermutet. Dieses sollte in den nächsten Experimenten näher untersucht werden.

Abb. 3.12: Immunoblot der subzelluläre Fraktionierung von Parkin in SH-SY5Y-Zellen. SH-SY5Y-Zellen wurden mit Parkin, BAG1 und BAG∆C überexprimiert und eine subzelluläre Fraktionierung durchgeführt. Im Anschluss wurde Parkin mittels Western Blot analysiert (A und B oben). Zur Kontrolle der korrekten Lysierung wurden Aktin (Zytosol), Cadherin (Membran/Organellen), Histon H2B (Nukleus) und Vimentin (Zytoskelett) verwendet. SH-SY5Y-Zellen zusätzlich mit 20 µM MG 132 für 12 Std inkubiert (B). 1: Parkin+pcDNA-LV; 2:

Parkin+BAG1; 3: Parkin+BAG∆C.

55

3.4.2 Untersuchungen zur Löslichkeit und Ubiquitinylierung von Parkin

Bei den in Kap. 3.1.2 beschriebenen Immunozytochemie-Versuchen konnten einzelne Parkin-Aggregate nachgewiesen werden und auch bei der subzellulären Lysierung in Kap. 3.4.1 wurden Vermutungen über eine verminderte Löslichkeit von Parkin bei Co-Expression von BAG1 gestellt. Diese Hypothese sollte in weiteren Versuchen objektiviert werden.

Hierfür wurde zunächst das Aggregationsverhalten von Parkin in Immunozytochemie-Versuchen morphologisch untersucht und im Anschluss manuell ausgezählt.

Morphologisch konnten in überexprimierten CSM14.1-Zellen sowohl viele kleinere peripher gelegene Parkin-Akkumulationen (s. Abb. 3.3), als auch singuläre perinukläre Aggregate dargestellt werden (s. Abb. 3.13 A). Diese Parkin-Akkumulation zeigte sich sowohl bei der alleinigen Expression von Parkin, als auch bei der Co-Transfektion mit BAG1 und BAG∆C.

Bei der Anfärbung von Tubulin zeigte sich zudem, dass das Zytoskelett eine Art „Korb“ um diese Aggregate bildet und diese so vom Rest des Zytoplasmas abschottet (s. Abb. 3.13 B).

Abb. 3.13: Fluoresenzmikroskopische Aufnahme (63x Objektiv) nach Überexpression von GFP-Parkin mit BAG1 in CSM14.1-Zellen. Dargestellt sind perinukleäre Parkin-Aggregationen mit einem umgebenden Tubulin-„Korb“. Tubulin wurde mit einem Cy3-gekoppeltem Antikörper gefärbt. A: GFP-Parkin; B: Tubulin; C:

DAPI; D: Überlagerung.

Zur Analyse, ob die Anwesenheit von BAG1 bzw. BAG∆C Einfluss auf das Akkumulationsverhalten von Parkin in der Immunozytochemie hat, erfolgte eine Auszählung der aggregathaltigen Zellen in den jeweiligen Konditionen unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Hierfür wurden auf je drei Cover-Slips alle CSM14.1-Zellen mit mindesten einem sichtbaren Aggregat gezählt und der Quotient zu allen transfizierten Zellen

A

D C

B

10 µm 10 µm

10 µm 10 µm

56

errechnet. Dabei wurden nur doppelt transfizierte Zellen berücksichtigt. Eine zweite Auszählung erfolgte mit MG 132 behandelten CSM14.1-Zellen.

Bei der Co-Transfektion von GFP-Parkin mit BAG1 konnte mit Hilfe eines Student-T-Testes (p<0,01) ein signifikant erhöhter Anteil von CSM14.1-Zellen mit Parkin-Aggregaten im Vergleich zur alleinigen Parkin-Transfektion und Co-Transfektion mit BAG∆C nachgewiesen werden. Bei der Anwesenheit von BAG1 hatten im Mittel 47,1% ⁺/- 1,5% der doppelt transfizierten Zellen ein oder mehr Parkin-Aggregate. Bei Überexpression von Parkin mit pcDNA-LV lag der Anteil durchschnittlich nur bei etwa 19,9% ⁺/- 3,1%. Ein annähernd ähnlicher Prozentsatz von aggregathaltigen Zellen ergab die Co-Transfektion von Parkin mit Bag∆C. Hier ließen sich bei 21,9% ⁺/- 3% der Zellen Parkin-Aggregate nachweisen (s. Abb.

3.14 A).

Ein vergleichbares Bild ergab die Auszählung der mit dem Proteasom-Inhibitor MG 132 behandelten CSM14.1-Zellen. Auch hier konnte ein signifikant erhöhter Anteil Parkin-aggregathaltiger Zellen bei einer Überexpression von Parkin mit BAG1 im Student-T-Test (p<0,05) nachgewiesen werden. Hier wiesen durchschnittlich 61,3 % ⁺/- 2,4% bzw. 64,6 % ⁺ /-2,6 der Zellen bei Co-Transfektion von Parkin mit pcDNA-LV bzw. BAG∆C zytoplasmatische Parkin-Aggregate auf. Dagegen konnten bei 83,4 % ⁺/- 2,8% der mit Parkin und BAG1 co-transfizierten Zellen Aggregate beobachtet werden (s. Abb. 3.14 B).

Diese Beobachtung bekräftigt die Vermutung, dass BAG1 zu einer vermehrten Aggregation von Parkin führt. Einen Einfluss von BAG∆C im Vergleich zur Negativkontrolle lässt sich jedoch nicht nachweisen.

Abb. 3.14: Auszählung von Parkin-aggregathaltiger CSM14.1-Zellen in Immunozytochemie-Versuchen.

Dargestellt sind die Mittelwerte zuzüglich Standardabweichung von überexprimierten CSM14.1-Zellen mit einem oder mehr Parkin-Aggregaten im Vergleich zu allen transfizierten Zellen (A). CSM14.1-Zellen wurden zusätzlich mit MG 132 für 12 Std inkubiert (B). * p<0,01; **p<0,05; 1: Parkin+pcDNA-LV, 2:

57

In weiteren Experimenten sollte darüber hinaus untersucht werden, ob Parkin BAG1-abhängig vermehrt ubiquitinyliert und hierdurch verstärkt in unlösliche Aggregate akkumuliert.

In weiteren Experimenten sollte darüber hinaus untersucht werden, ob Parkin BAG1-abhängig vermehrt ubiquitinyliert und hierdurch verstärkt in unlösliche Aggregate akkumuliert.

Im Dokument Funktionelle Charakterisierung einer neuen Proteininteraktion zwischen Parkin und BAG1 (Seite 53-0)