4. Ergebnisse
4.1. Einfluss von TGF-β auf die Expression extrazellulärer Matrixproteine
4.1.3. Immunhistochemische Verifizierung der gewonnenen Ergebnisse . 73
Ergebnisse _______________________________________________________________
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.3.1. Kollagen I
0 h Inkubation mit TGF-β 2 h Inkubation mit TGF-β 8 h Inkubation mit TGF-β
(10ng/ml) (10ng/ml) (10ng/ml)
24 h Inkubation mit TGF-β 24 h Kontrollwert ohne Stimulation mit TGF-β
(10ng/ml) (10ng/ml)
24 h Durchlicht Aufnahme
der zuvor gezeigten Zelle nach Inkubation mit TGF-β (10ng/ml) für 24 Stunden
Abb.4.1.3.1.a Immunhistochemische Darstellung von Kollagen I
Repräsentative konfokale Aufnahmen einzelner Herzmuskelzellen inkubiert, mit TGF-β (10ng/ml) für 0, 2, 8 und 24 h. Zur Kontrolle dienten zusätzlich unstimulierte Zellen nach 24-stündiger Kultivierung. Die Zellen wurden mit einem Cy5 Zweit-Antikörper gefärbt und mit einer Wellenlänge von 649nm angeregt. Je gelber und heller die Zelle leuchtet, desto mehr Kollagen ist enthalten.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.3.2. Elastin
0 h Inkubation mit TGF-β 2 h Inkubation mit TGF-β 8 h Inkubation mit TGF-β
(10ng/ml) (10ng/ml) (10ng/ml)
24 h Inkubation mit TGF-β 24 h Kontrollwert ohne Stimulation mit TGF-β
(10ng/ml) (10ng/ml)
Abb.4.1.3.2.a Immunhistochemische Darstellung von Elastin
Repräsentative konfokale Aufnahmen einzelner Herzmuskelzellen inkubiert mit TGF-β (10ng/ml) für 0, 2, 8 und 24 h. Zur Kontrolle dienten zusätzlich unstimulierte Zellen nach 24-stündiger Kultivierung. Die Zellen wurden mit einem FITC/Cy2 Zweit-Antikörper gefärbt und mit einer Wellenlänge von 490/494nm angeregt. Je gelber und heller die Zelle leuchtet, desto mehr Elastin ist enthalten.
Der FITC/Cy2 Zweit-Antikörper hat ein grün fluoreszierendes Licht, zur besseren Vergleichbarkeit mit den andere Proteinen wurde am Computer die Farbe nachbehandelt.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.3.3. Fibronektin
0 h Inkubation mit TGF-β 2 h Inkubation mit TGF-β 8 h Inkubation mit TGF-β
(10ng/ml) (10ng/ml) (10ng/ml)
24 h Inkubation mit TGF-β 24 h Kontrollwert ohne Stimulation mit TGF-β
(10ng/ml) (10ng/ml)
Abb.4.1.3.3.a Immunhistochemische Darstellung von Fibronektin
Repräsentative konfokale Aufnahmen einzelner Herzmuskelzellen inkubiert mit TGF-β (10ng/ml) für 0, 2, 8 und 24 h. Zur Kontrolle dienten zusätzlich unstimulierte Zellen nach 24-stündiger Kultivierung. Die Zellen wurden mit einem Cy5 Zweit-Antikörper gefärbt und mit einer Wellenlänge von 649nm angeregt. Je gelber und heller die Zelle leuchtet, desto mehr Fibronektin ist enthalten.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.3.4. Laminin
0 hInkubation mit TGF-β 2 h Inkubation mit TGF-β 8 h Inkubation mit TGF-β
(10ng/ml) (10ng/ml) (10ng/ml)
24 h Inkubation mit TGF-β 24 h Kontrollwert ohne Stimulation mit TGF-β
(10ng/ml) (10ng/ml)
Abb.4.1.3.4.a Immunhistochemische Darstellung von Fibronektin
Repräsentative konfokale Aufnahmen einzelner Herzmuskelzellen inkubiert mit TGF-β (10ng/ml) für 0, 2, 8 und 24 h. Zur Kontrolle dienten zusätzlich unstimulierte Zellen nach 24-stündiger Kultivierung. Die Zellen wurden mit einem Cy5 Zweit-Antikörper gefärbt und mit einer Wellenlänge von 649nm angeregt. Je gelber und heller die Zelle leuchtet, desto mehr Laminin ist enthalten.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.3.5. Laminin-Rezeptor
0 h Inkubation mit TGF-β 2 h Inkubation mit TGF-β 8 h Inkubation mit TGF-β
(10ng/ml) (10ng/ml) (10ng/ml)
24 h Inkubation mit TGF-β 24 h Kontrollwert ohne Stimulation mit TGF-β
(10ng/ml) (10ng/ml)
Abb.4.1.3.5.a Immunhistochemische Darstellung von Fibronektin
Repräsentative konfokale Aufnahmen einzelner Herzmuskelzellen inkubiert mit TGF-β (10ng/ml) für 0, 2, 8 und 24 h. Zur Kontrolle dienten zusätzlich unstimulierte Zellen nach 24-stündiger Kultivierung. Die Zellen wurden mit einem Cy5 Zweit-Antikörper gefärbt und mit einer Wellenlänge von 649nm angeregt. Je gelber und heller die Zelle leuchtet, desto mehr des Laminin-Rezeptors ist enthalten.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.4. Expression der ECM nach Stimulation mit TGF-β auf mRNA Ebene
Um die auf Proteinebene gewonnenen Ergebnisse zu verifizieren, wurde die verstärkte Expression extrazellulärer Matrixproteine auf mRNA Ebene mittels Real time PCR nachgewiesen. Die Abbildungen 4.1.4.1.a - 4.1.4.5.a zeigen die Expression der extrazellulären Matrixproteine auf mRNA Ebene nach 8-stündiger Inkubation der Kardiomyozyten mit 1 ng/ml und 10 ng/ml TGF-β.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.4.1. Kollagen I
Bei diesem Versuch zeigt sich eine signifikante Erhöhung der Kollagen I-mRNA-Expression nach Stimulation der Kardiomyozyten mit TGF-β. Hier fällt auf, dass sich die Expression auf Ebene der mRNA zwar signifikant erhöht, sich aber nicht konzentrationsabhängig verhält. Die mRNA-Expression von Kollagen I ist bei der Konzentration von 1 ng/ml TGF-β größer als bei einem Stimulationswert von 10 ng/ml.
0 1 2 3 4
C T1 T10
Kontrolle TGF-β1ng TGF-β10ng relative mRNAExpression (x-fache der Kontrolle)
*
*
0 1 2 3 4
C T1 T10
Kontrolle TGF-β1ng TGF-β10ng relative mRNAExpression (x-fache der Kontrolle)
*
*
Abb. 4.1.4.1.a mRNA-Expression für Kollagen I nach Stimulation mit TGF-β
Es zeigt sich ein nicht konzentrationsabhängiger Anstieg der mRNA-Expression für Kollagen I nach TGF-β Stimulation (8h).
Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM aus n=7 Versuchen. * = p < 0,05 versus Kontrolle.
Zur Kontrolle dienten Zellen der gleichen Präparation ohne Zugabe von TGF-β.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.4.2. Elastin
Bei diesem Versuch zeigt sich eine konzentrationsabhängige Erhöhung der mRNA-Expression von Elastin nach Stimulation mit TGF-β. Hierbei stellt sich aber nur nach Inkubation mit einer Konzentration von 10 ng/ml TGF-β ein signifikant erhöhter Wert ein.
0 1 2 3
1 2 3
Kontrolle TGF-β1ng TGF-β10ng relative mRNAExpression (x-fache der Kontrolle)
*
0 1 2 3
1 2 3
Kontrolle TGF-β1ng TGF-β10ng relative mRNAExpression (x-fache der Kontrolle)
*
Abb. 4.1.4.2.a mRNA-Expression für Elastin nach Stimulation mit TGF-β
Es zeigt sich ein konzentrationsabhängiger Anstieg der mRNA-Expression für Elastin nach TGF-β Stimulation (8h).
Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM aus n=7 Versuchen. * = p < 0,05 versus Kontrolle.
Zur Kontrolle dienten Zellen der gleichen Präparation ohne Zugabe von TGF-β.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.4.3. Fibronektin
Bei diesem Versuch zeigt sich eine konzentrationsabhängige signifikante Erhöhung der mRNA-Expression von Fibronektin nach Stimulation der Kardiomyozyten mit TGF-β.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3
Kontrolle TGF-β1ng TGF-β10ng relative mRNAExpression (x-fache der Kontrolle)
*
*
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3
Kontrolle TGF-β1ng TGF-β10ng relative mRNAExpression (x-fache der Kontrolle)
*
*
Abb. 4.1.4.3.a mRNA-Expression für Fibronektin nach Stimulation mit TGF-β
Es zeigt sich ein konzentrationsabhängiger Anstieg der mRNA-Expression für Fibronektin nach TGF-β Stimulation (8h).
Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM aus n=7 Versuchen. * = p < 0,05 versus Kontrolle.
Zur Kontrolle dienten Zellen der gleichen Präparation ohne Zugabe von TGF-β.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.4.4. Laminin
Auch die mRNA-Expression von Laminin stellt sich nach Stimulation mit TGF-β als konzentrationsabhängige und signifikante Erhöhung dar.
0 1 2 3 4 5 6
1 2 3
Kontrolle TGF-β1ng TGF-β10ng relative mRNAExpression (x-fache der Kontrolle)
*
*
0 1 2 3 4 5 6
1 2 3
Kontrolle TGF-β1ng TGF-β10ng relative mRNAExpression (x-fache der Kontrolle)
*
*
Abb. 4.1.4.4.a mRNA-Expression für Laminin nach Stimulation mit TGF-β
Es zeigt sich ein konzentrationsabhängiger Anstieg der mRNA-Expression für Laminin nach TGF-β Stimulation (8h).
Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM aus n=7 Versuchen. * = p < 0,05 versus Kontrolle.
Zur Kontrolle dienten Zellen der gleichen Präparation ohne Zugabe von TGF-β.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.1.4.5. Laminin-Rezeptor
Bei diesem Versuch zeigt sich keine konzentrationsabhängige Erhöhung der Expression der mRNA des Laminin-Rezeptors nach Stimulation mit TGF-β. Die mRNA-Expression bei einer TGF-β-Konzentration von 1 ng/ml übersteigt nicht den Kontrollwert. Nur bei einer Konzentration von 10 ng/ml TGF-β manifestiert sich ein signifikanter Anstieg der mRNA des Laminin-Rezeptors.
0 1 2
1 2 3
Kontrolle TGF-β1ng TGF-β10ng relative mRNAExpression (x-fache der Kontrolle)
*
0 1 2
1 2 3
Kontrolle TGF-β1ng TGF-β10ng relative mRNAExpression (x-fache der Kontrolle)
*
Abb. 4.1.4.5.a mRNA Expression für den Laminin-Rezeptor nach Stimulation mit
TGF-β
Es zeigt sich ein konzentrationsabhängiger Anstieg der mRNA-Expression für den Laminin-Rezetor nach TGF-β Stimulation (8h).
Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM aus n=7 Versuchen. * = p < 0,05 versus Kontrolle.
Zur Kontrolle dienten Zellen der gleichen Präparation ohne Zugabe von TGF-β.
Ergebnisse _______________________________________________________________
4.2. Nachweis der Beteiligung von mitogen aktivierten