Immunhistochemische Färbung

Zur Anfärbung von EPO-Protein bzw. des EPOR wurden die oben angegebenen Primäranti-körper angewendet. Zur farblichen Darstellung der gebundenen AntiPrimäranti-körper wurde dann das EnVision Detection System von Dako eingesetzt, dessen Reagenz aus einem Dextran-Grundgerüst besteht, an den zahlreiche Meerrettich-Peroxidase-Moleküle (HRP) und Sekun-därantikörper gekoppelt sind, welche gleichermaßen mit Maus- wie Kaninchenantikörpern

reagieren. In einem weiteren Schritt wurde dann Diaminobenzidinlösung (DAB) zusammen mit dem wasserstoffperoxidhaltigen Substratpuffer zugegeben, wobei mittels der Peroxidase ein braunes Endprodukt am Ort des Zielantigens entsteht.

Die genauen Reaktionsschritte des Färbeprotokolls werden im Folgenden beschrieben. Sämt-liche Verdünnungen der Antikörper, des Farbstoffs und des Wasserstoffperoxids wurden stets kurz vor der Anwendung frisch angesetzt und alle Schritte des Protokolls ohne Unterbrech-ungen durchgeführt. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei Raumtemperatur. Bei Waschschritten wurden die Präparate, falls nicht anders beschrieben, für ca. 30 Sekunden in der Lösung ge-schwenkt.

2.2.2.1 Entparaffinierung

Zur Durchführung der immunhistochemischen Färbungen war es zunächst notwendig die Schnitte zu entparaffinieren. Dazu wurden die Präparate eingangs für 20 min im Xylol-Bad gehalten und anschließend zur Rehydratation in einer absteigenden Ethanolreihe, beginnend bei 100% (3x) über 96% (2x) und 70% (1x), gewaschen. Abschließend erfolgten drei Spül-ungen in entmineralisiertem Wasser.

2.2.2.2 Vorbehandlung der Präparate

Anschließend wurden die Schnitte zur Hemmung der endogenen Peroxidase-Moleküle für 20 min in 6%ige Wasserstoffperoxid-Lösung gegeben und daraufhin dreimal in entmineralisier-tem Wasser gewaschen. Zur Pufferung des pH-Wertes wurden die Präparate nun für ca. eine Minute in TRIS gehalten und dann, nach vorheriger Entfernung überschüssiger Flüssigkeit, mit je 100 µl BSA für 20 min in einer feuchten Kammer beschickt. Das BSA hatte die Funk-tion, die Bindung der Antikörper an unerwünschte Epitope zu blockieren und die bessere Ver-teilung des Antikörpers auf dem Objektträger zu gewährleisten. Im Protokoll für die Färbung von EPO-Protein wurde die BSA-Anwendung ausgelassen, da hier eine Kreuzreaktion des Brückenantikörpers mit BSA nachzuweisen war.

2.2.2.3 Primärantikörper

Im nächsten Schritt wurden nach Entfernen überschüssiger Lösung 100 µl der jeweiligen Pri-märantikörper mit einer Konzentration von 2 µg/ml aufgetragen und für 60 min in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Verdünnung des EPOR-Antikörpers erfolgte dabei mit rei-nem TRIS-Puffer, wohingegen die Verdünnung des EPO-Antikörpers mit TRIS-Puffer, dem zuvor Tween-Reagenz im Verhältnis von 1:200 zugesetzt wurde, stattfand. Das Tween er-leichterte durch Herabsetzen der Oberflächenspannung die Verteilung der Antikörper auf dem

Objektträger, was bei dem EPOR-Antikörper durch das vorherige Auftragen des BSA ge-währleistet war. Nach Ablauf der 60 min wurden die Schnitte zweimal in TRIS-Puffer gewa-schen.

2.2.2.4 Brückenantikörper

Für die Färbereaktion mittels EPO-Protein-Antikörper war der Einsatz eines Brückenantikör-pers notwendig, da der EPO-Antikörper von der Ziege stammte, das Dako REAL™ EnVisi-on™ Detection System allerdings nur mit Antikörpern von Maus oder Kaninchen reagiert.

So wurde für die Färbung im EPO-Protein-Protokoll zusätzlich ein Kaninchen Anti-Ziege-Antikörper eingesetzt, der gegen den Fc-Teil der gebundenen EPO-Anti-Ziege-Antikörper gerichtet war und somit dann mit seinem Kaninchen-Fc-Teil als Angriffsziel für die im EnVision enthalte-nen Sekundärantikörper dieenthalte-nen konnte.

Dazu wurden 100 µl Kaninchen Anti-Ziege-Antikörper mit einer Konzentration von 4,5 µg/ml auf die Schnitte aufgebracht und diese für 30 min in einer feuchten Kammer inkubiert.

Anschließend wurde zweimal mit TRIS-Puffer gewaschen.

2.2.2.5 Sekundärantikörper

Um die spezifisch erfolgte Bindung der Primärantikörper farblich darstellen zu können, wurde das EnVision-Reagenz aus dem Dako REAL™ EnVision™ Detection System verwendet. Die Anti-Maus/Kaninchen-Antikörper, die zahlreich an das im Reagenz enthaltene Polymer ge-koppelt waren, konnten nun spezifisch an die Fc-Teile des EPOR-Primärantikörpers bzw. des Brückenantikörpers (in der EPO-Protein-Färbung) binden. Dieses bildete die Grundlage für eine ortspezifische Färbereaktion.

Nach Protokoll wurden 100 µl des EnVision-Reagenzes je Präparat aufgetragen und abermals für 30 min inkubiert. Abschließend wurde erneut zwei Mal mit TRIS-Puffer gewaschen.

2.2.2.6 Färbereaktion

Um nun ein gefärbtes Endprodukt nach anfangs erläuterter Methode herstellen zu können, wurde zunächst das Farbreagenz im folgenden Verhältnis aus den im Dako REAL™ EnVisi-on™ Detection System enthaltenen Bestandteilen hergestellt:

50 µl Dako REAL™ Substrate Buffer

1 µl Dako REAL™ DAB+ Chromogen (50x konzentriert).

Die Lösung wurde dann zeitnah mit 100 µl je Schnitt aufgebracht und in einer abgedunkelten feuchten Kammer für 20 min belassen (DAB-Chromogen ist lichtempfindlich).

In einer Reaktion mittels der am Polymer des EnVision-Reagenzes gekoppelten Per-oxidase-Moleküle (HRP), des DAB-Chromogens sowie des im Puffer enthalte-nen Wasserstoffperoxids entstand dann der braune Farbstoff spezifisch am Ort der Bin-dung des Primärantikörpers.

Nach Abschluss der Inkubation wurde vier Mal mit entmineralisiertem Wasser gespült.

2.2.2.7 Gegenfärbung

Zur Kerngegenfärbung wurden die Schnitte für 2 min in Mayers-Hämalaun-Lösung getaucht und anschließend für 1 min unter laufendem Leitungswasser gebläut.

2.2.2.8 Eindecken

Zum Eindecken wurden die Schnitte zunächst durch Behandlung in einer aufsteigenden Etha-nolreihe, beginnend bei 70% (1x) über 96% (2x) und abschließend 100% (3x), entwässert und dann dreimal im Xylolbad gespült.

Als Einschlussmittel wurde schließlich ein Tropfen Cytoseal 60 verwendet und mit einem Deckgläschen abgeschlossen.

2.2.2.9 Positiv- und Negativkontrollen

Zur initialen Prüfung der Färbereaktionen wurden anfangs einige Präparate humaner Nieren als Positivkontrollen nach den obigen Protokollen gefärbt.

Ebenso wurden Negativkontrollen aus Präparaten von humanen Nieren und aus als bereits positiv befundenen Glioblastompräparaten erstellt. Dazu wurden die Präparate nach den obi-gen EPO- bzw. EPOR-Protokollen gefärbt, wobei jeweils nur die Primärantikörperlösung durch TRIS-Puffer gleicher Menge (100 µl) ersetzt wurde. Alle anderen Parameter blieben identisch. Die Durchführung erfolgte im gemeinsamen Arbeitsschritt mit den regulär zu fär-benden Präparaten bzw. Positivkontrollen, so dass ein direkter Vergleich der Negativkontrol-len mit den normal angefärbten Schnitten desselben Arbeitsganges möglich war.

Abbildung 4 Immunhistochemie:

links EPO-Protokoll, rechts EPOR-Protokoll