Verwendete Materialien Hersteller, Firma, etc.
Detektionskit DAKO Envision Flex+ K8002 mit: Puffer, Peroxidaseblock, Linkerlösung, Detektionsenzym/Sekundärantikörper, Chromogen-Substrat-Gemisch Eindeckung tissue tek 4770 Coverslipping film
Eindeckungsautomat Skura, tissue tek film
Ethanol 96% vollvergällt UN1170 und 99% vergällt mit MEK, Firma Chemsolute ThGeyer
Färbeautomat DAKO Autostainer link 48
Hematoxylin DAKU RTU K8008
Objektträger thermo scientific superfrost plus 25x75x1mm
Primärantikörper Dako, Monoclonal Mouse Anti Human p53 Protein Clone DO 7 und Santa Cruz Biotechnology monoclonal mouse Antibody sc-56330 p16 (JC8)
Software DAKOlink
Vorbehandlugskit DAKO target retrieval solution high ph Vorbehandlungsautomat DAKO Ptlink
Xylol Chemsolute ThGeyer Xylol 0,86g/ml
Tabelle 2: benötigte Chemikalien und Geräte
Seite | 39 2.4.1 Einführung
Abseits der individuellen Metadaten der Patienten sollten auch auf zellulärer Ebene Kriterien zur Charakterisierung des Patientenkollektivs geprüft werden. So sollten einerseits die Verbesserung der Standardisierung und Vergleichbarkeit des Kollektivs erreicht werden und andererseits mögliche Zusammenhänge typischer Proteinveränderungen des Pankreaskarzinoms mit dem DSS oder gar den ausgewählten Markern uPAR und c-MYC als etwaige Störvariablen identifizierbar werden.
2.4.2 p53
Das p53-Gen befindet sich auf dem Chromosom 17p. Bei 70% aller Pankreaskarzinome ist p53 mutiert, wodurch es zur Veränderung des p53-Proteins kommt (Redston et al. 1994).
Intakte p53-Proteine induzieren die Expression von Genen, z. B. der DNA-Reparatur bzw.
der Apoptoseinduktion, und sind so in der Lage, an verschiedenen Punkten des Zellzyklus einen Arrest zu induzieren. Ist p53 mutiert, erhöht sich die Überlebenswahrscheinlichkeit einer Zelle mit schadhafter DNA und die p53-Mutation ist eine ausgesprochen häufige Mutation bei allen malignen Tumoren.
Die Nachweisbarkeit des p53 ist bei intakten Zellen durch die kurze Halbwertszeit des Proteins limitiert (Momand et al. 1992). Intaktes p53 wird abgebaut und ist somit einer antikörperbasierten Färbung nicht zugänglich. Durch Mutationen im p53-Gen verändert sich das p53-Protein und entzieht sich den Abbaumechanismen, sodass es in der Konzentration im Zellkern ansteigt und z. B. immunhistochemisch, also durch Antikörper, gebunden und angefärbt werden kann. Durch die immunhistochemische Färbung lassen sich also in einem Schnitt solche Zellkerne mit hohen p53-Proteinspiegeln von solchen mit weniger hohen bis negativen Spiegeln unterscheiden.
Das Prinzip beruht also auf der Affinität eines Antikörpers, mit einem bestimmten Epitop eine Antigen-Antikörperbindung einzugehen. Meist werden verschiedene Antikörper verwendet, wobei ein Primärantikörper das gesuchte Epitop bindet. Ein weiterer Antikörper dient der Verbindung mit den lichtmikroskopisch detektierbaren Reagenzien.
Dieser zweite Antikörper hat dann eine Affinität zu Epitopen des Primärantikörpers. Diese sogenannte Zwei-Schritt-Methode erhöht die Signalintensität, weil mehrere Sekundärantikörper den Primärantikörper binden können und somit mittelbar das Targetprotein besser angefärbt werden kann, was sich positiv auf die Sensitivität des Verfahrens auswirkt.
Im klassischen IHC-Protokoll wird letztendlich immer eine am Sekundärantikörper sesshafte Enzym-Substrat-Reaktion durchgeführt. Im vorliegenden Fall ist das Enzym, welches spezifisch den Sekundärantikörper bindet, eine Peroxidase. Wenn Sekundärantikörper und Enzym am Primärantikörper gebunden sind, wird ein
Substrat-Seite | 40 Chromogengemisch hinzugefügt. Es kommt zur Enzym-Substrat-Reaktion und das Chromogen wird detektierbar. Im vorliegenden Fall reagiert zugegebenes Diaminobenzidin (DAB) mit der sesshaften Peroxidase, sodass ein brauner amorpher Farbstoff entsteht, der sich lichtmikroskopisch auf den Zellkern begrenzt.
Durchführung:
Analog zu den bei den FISH-Experimenten ausgesuchten Gewebsproben der Patienten wurden weitere Schnitte identischer Lokalisation am Mikrotom angefertigt und dem immunhistochemischen Labor der UMG zugeleitet. Die Aufbereitung und Färbung erfolgte nach den standardisierten Protokollen der klinischen Routinediagnostik mit automatisierten Färbeautomaten, um die methodischen Schwankungen gering zu halten.
Die Einzelheiten sind hier daher nur kurz beschrieben, ein Originalprotokoll ist exemplarisch als Anlage 1 unter Kapitel 6 dieser Arbeit beigefügt.
Es erfolgte die automatisierte Entparaffinierung und Rehydratisierung des FFPE-Gewebes als Vorbehandlung. Zur optimalen Vorbereitung der Antigen-Antikörperbindung erfolgte die Demaskierung durch eine Hitzevorbehandlung, sowie eine standardisierte alkalische Pufferlösung (target retrieval solution). Darauf folgte das antikörperspezifische Protokoll im Färbeautomat. Zunächst wurde mittels Peroxidaseblock die endogene Peroxidase beseitigt.
Darauf erfolgte die Zugabe des Primärantikörpers (Antihuman p53-Protein als monoklonaler Mausantikörper). Nach Zugabe einer Linkerlösung (Signalverstärkung und antimikrobielles Agens) folgte die Zugabe des Sekundärantikörpers (Peroxidase-gekoppelter Ziegenantikörper gegen Maus-Immunglobulin). Nach Inkubation wurde das Chromogen-Substratgemisch hinzugefügt. Zum Abschluss folgte die Kerngegenfärbung mit HE. Selbstverständlich waren diese Schritte jeweils von Waschungen mit Waschpuffern eingerahmt. Zum Abschluss wurden die Schnitte in destilliertem Wasser gewaschen und Luftgetrocknet.
2.4.3 p16
p16 ist ähnlich wie p53 ein Vermittler von Zellzyklusarresten, dessen Mutation also zu erleichterter Proliferation von Zellen mit schadhafter DNA führt. Dieser Effekt basiert auf dem Einfluss auf die Cyklin-abhängigen Kinasen, deren zentrale Rolle in der Zellzykluskontrolle in dieser Arbeit schon einmal angesprochen wurde. Insbesondere jene Kinasen, die das Retinoblastom Protein (Rb1) phosphorylieren werden vom p16 inhibiert.
Dieser klassische Signalweg der Tumorsuppressorproteine p16 und Rb1 ist bei nahezu allen Pankreaskarzinomen (98%) mutiert (Schutte et al. 1997). Gemäß der WHO- Tumorklassifikation haben 40% aller Patienten mit Pankreaskarzinom eine p16-Mutation (Hamilton und Aaltonen 2000).
Seite | 41 Die methodische Durchführung zur Vorbereitung des immunhistochemischen Nachweises erfolgte analog zum oben geschilderten Prozedere des p53-Assays. Auch der p16- Antikörper war ein monoklonaler Mausantikörper, der Peroxidase-gekoppelt war und im Verlauf mit einem DAB-Gemisch gesättigt wurde, was bei enzymatischer Reaktion zum Nachweis eines braunen Chromogens führte. Allerdings ist das p16 typischerweise nicht auf den Zellkern beschränkt. Ein exemplarisches Originalprotokoll ist dieser Arbeit ebenfalls als Anlage 2 unter Kapitel 6 beigefügt.