Immunhistochemie

Aus 3–4 Foxp3EGFP Reportermäusen wurden je Gruppe an den Tagen 7, 14 und 30 nach ECL und MCAO die Gehirne und Milzen für die Immunhistochemie aufgearbeitet.

Organentnahme und Kryokonservierung

Die Perfusion wurde wie in Kapitel 2.2.7.1 beschrieben durchgeführt. Nach der Perfusion mit 100 ml NaCl-Lsg. wurde die Maus mit weiteren 30 ml eiskaltem PFA 4 % für 5 min perfundiert. Dann wurde die Milz entnommen und in ein Zentrifugenröhrchen mit 5 ml eiskaltem PFA 4 % gegeben. Die Schädeldecke wurde mit der Fellschere geöffnet und das gesamte Gehirn mit einem löffelförmigen Spatel entnommen und ebenfalls in 5 ml eiskaltes PFA 4 % gegeben. Die Organe wurden über Nacht bei 4 °C im PFA 4 % gelassen. Anschließend wurden die Organe jeweils über Nacht bei 4 °C in 10 %, 20 % und 30 % Sucrose-Lsg. gegeben. Nach der Sucrose-Reihe wurden die Organe kryokonserviert. Hierfür wurde zunächst 2-Methylbutan mit Trockeneis auf -60 °C herunter gekühlt. Anschließend wurden die Organe für 30 s in das

2-Methylbutan gegeben und danach auf Filterpapier gelegt, um das überschüssige 2-Methylbutan zu entfernen. Die eingefrorenen Organe wurden bei -80 °C gelagert.

2.2.8.2 Anfertigung der Kryoschnitte

Aus den kompletten Gehirnen mit ECL wurden 12 µm dicke horizontale Schnitte angefertigt. Aus den kompletten Gehirnen mit MCAO wurden 12 µm dicke Frontalschnitte angefertigt. Von den Milzen wurden 12 µm dicke Querschnitte angefertigt. Die Organe wurden mit einem kleinen Tropfen Einbettmedium auf der Schneidevorrichtung des Kryostats befestigt. Die Organe wurden während des Schneidevorgangs auf Temperaturen zwischen -20 °C und -23 °C gebracht. Pro Objektträger mit Adhäsionsbeschichtung wurden von den Gehirnen 4–5 Schnitte und von den Milzen 3 Schnitte angefertigt. Die Kryoschnitte wurden bis zur Färbung bei -80 °C gelagert.

2.2.8.3 Allgemeines immunhistochemisches Färbeprotokoll

Die Schnitte wurden auf RT gebracht, an der Luft getrocknet und auf dem Objektträger mit dem Fettstift umrandet, um ein Zerlaufen der Reaktionslösungen zu verhindern. Die Schnitte wurden mit zweimal PBS gewaschen, für 15min bei RT mit PTX 0,2 % permeabilisiert und anschließend mit 5 %iger Blocklösung für 45 min bei RT inkubiert, um unspezifische Bindestellen abzusättigen. Danach wurde die Färbung mit den Primärantikörpern und Sekundärantikörpern durchgeführt. Die Verdünnungen für die Färbereaktion sind in Tabelle 8 und Tabelle 9 aufgelistet. Die Inkubation zur Färbung mit Antikörpern fand bei 4 °C statt. Falls nicht anders beschrieben, fand die Färbung mit den Primär- und Sekundärantikörper in 5 %iger Blocklösung statt. Zwischen den einzelnen Färbeschritten wurden die Schnitte jeweils dreimal mit PTX 0,2 % gewaschen. Am Ende des Färbeprotokolls wurden die Schnitte mit DAPI für 10 min bei RT inkubiert, um die Nukleinsäure in Zellkernen zu markieren. Danach wurden die Schnitte einmal mit PTX 0,2 % und zweimal mit PBS gewaschen. Die gefärbten Schnitte wurden mit Immu-Mount eingedeckt und mit Deckgläsern versiegelt. Die Lagerung der gefärbten Schnitte erfolgte bei 4 °C.

2.2.8.4 Färbeprotokoll mit Antikörpern gegen CD4 und GFP

Gehirnschnitte und Milzen MCAO Mäusen wurden gegen CD4 und GFP gefärbt. Im ersten Färbeschritt wurden anti-CD4 aus Ratte und anti-GFP aus Kaninchen auf die Schnitte gegeben. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach den Waschschritten mit PTX 0,2 % wurden die Schnitte mit Ratte Alexa 568 und anti-Kaninchen Alexa 488 für 4 h inkubiert.

2.2.8.5

2.2.8.6

2.2.8.7

2.2.8.8

Färbeprotokoll mit Antikörpern gegen GFP, MHCII und Iba1

Die Färbung mit Antikörpern gegen GFP, MHCII und Iba1 wurde an Gehirn- und Milzschnitten aus ECL und MCAO Mäusen durchgeführt.

Im ersten Färbschritt wurden die Schnitte mit anti-MHCII aus Ratte und anti-GFP aus Huhn über Nacht inkubiert. Nach dem Waschen erfolgte die Inkubation mit anti-Ratte Alexa 633 und anti-Huhn FITC für 4 h. Die Schnitte wurden erneut gewaschen und mit Iba1 aus Kaninchen über Nacht inkubiert. Im letzten Färbeschritt wurde anti-Kaninchen für 4 h auf die Schnitte gegeben.

Färbeprotokoll mit Antikörpern gegen GFP, MHCII und CD11c

Die Färbung mit Antikörpern gegen GFP, MHCII und CD11c wurde an Gehirn- und Milzschnitten von MCAO Mäusen durchgeführt.

Im ersten Färbeschritt wurde anti-MHCII aus Ratte zusammen mit anti-GFP aus Huhn auf die Schnitte gegeben und über Nacht inkubiert. Nach dem Waschen wurden anti-Ratte Alexa 633 und anti-Huhn FITC für 4 h mit den Schnitten inkubiert. Der biotinylierte anti-CD11c wurde in PTX 0,2 %, also ohne Normales Ziegenserum, auf die Schnitte gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach den Waschschritten erfolgte 4 h Inkubation mit Streptavidin Alexa 568 in Blocklösung.

Färbeprotokoll mit Antikörpern gegen GFP, CD4 und Laminin

Die Färbung wurde an Gehirnschnitten von MCAO Mäusen durchgeführt. Zunächst wurde der Antikörper aus Huhn gegen Laminin in PTX 0,2 % auf die Schnitte gegeben und über Nacht inkubiert. Die Schnitte wurden gewaschen und mit anti-Huhn Alexa 633 für 4 h inkubiert. Anschließend erfolgte die Färbung mit anti-CD4 aus Ratte und anti-GFP aus Kaninchen über Nacht. Nach den drei Waschschritten mit PTX 0,2 % wurden die Schnitte mit anti-Ratte Alexa 568 und anti-Kaninchen Alexa 488 in Blocklösung für 4 h inkubiert.

Kontrollfärbungen

Die Färbungen der Milzen dienten als Positivkontrolle für die Antikörper gegen GFP, CD4, MHCII, CD11c und Iba1. Die kontralateralen Hemisphären dienten als Negativkontrolle für die Antikörper gegen GFP, CD4, MHCII und CD11c. In den Negativkontrollen wurde bei keinem der Antiköper eine positive Reaktivität im Parenchym festgestellt. Durch das Weglassen der primären Antikörper während der Färbung wurde eine Kreuzreaktivität der sekundären Antikörper mit dem lädierten neuronalem Gewebe ausgeschlossen. Ratten IgG2bwurde als Isotypkontrolle für MHCII und biotinyliertes IgG aus armenischem Hamster als Isotypkontrolle für CD11c verwendet. Die Kontrollen zeigten keine positive Reaktivität mit dem Zielgewebe.

2.2.8.9 Mikroskopie

Von den Gehirnschnitten wurden konfokale Aufnahmen am Leica TCS-SL und am Zeiss LSM5 Exciter angefertigt. Weißlichtaufnahmen der Gehirnschnitte wurden am Olympus BX 51 angefertigt.

Im Dokument Lokalisierung und Charakterisierung Foxp3+ regulatorischer T-Zellen bis zu 30 Tage nach mechanischer und ischämischer Läsion des Gehirns (Seite 54-57)