IgY-Gehalt im Eigelb und seinen Fraktionen

Mithilfe eines ELISA´s erfolgte die Quantifizierung von aktivem IgY in den mit CMC 30 oder CMC 60 000 gewonnenen ggt. LDL- und Livetin-Fraktionen (Kap. 3.3.5, Seite 49) (CMC-Konzentration: 0,417 %ig) entsprechend der in Kap. 3.4.4.5 (Seite 82) beschriebenen Methode, um Unterschiede im Trennerfolg des Plasmas und möglicherweise auch Unterschiede in den Fraktionsreinheiten zu bestimmen. Es wurden ebenfalls, im Gegensatz zu vorhergehenden Versuchen (Kap. 4.3.1 (Seite 162): Auswaagen (TM) und Kap. 4.3.2 (Seite 165): Gesamtprotein- und Gesamtfettgehalt), past. Proben untersucht, um zusätzlich den Einfluss einer Pasteurisation auf die IgY-Aktivität zu prüfen. Der Einfluss des hier angewendeten Gefriertrocknungsverfahrens auf die biologische Aktivität des IgY wurde, mithilfe des ELISA´s, nicht untersucht. Bereits JARADAT und MARQUARDT (2000) untersuchten die Aktivität des IgY (gelöst in Wasser) anhand eines ELISA´s und stellten fest, dass die IgY-Aktivität infolge des Gefriertrocknungsprozesses (Schnellgefrieren bei - 20 °C, Gefriertrocknung bei - 45 °C für 24 h) um 10 % abnahm. NILSSON und LARSSON (2007) beobachteten dagegen, dass sie vor und nach Gefriertrocknung gleich war. Das IgY ist Teil des γ-Livetins, welches natürlicherweise in der Livetin-Fraktion vorkommt (Kap. 2.1.2,

Seite 66). Durch eine unzureichende Trennung des Plasmas können Verunreinigungen der LDL-Fraktion mit IgY entstehen.

Die Abbildung 49 stellt die ermittelten Gehalte an aktivem IgY [µg/mg] in den mit unterschiedlichen CMC´s isolierten Eigelbfraktionen (LIVETINE/LDL CMC 30/60 000, LIVETINE PAST/LDL PAST CMC 30/60 000) grafisch dar. Die Angaben an aktivem IgY [µg] gelten pro mg Probentrockenmasse. Die Restfeuchten untersuchter Proben werden im Anhang in Kap. 8.7 (Seite 226) aufgeführt. Die Tabelle 33/Tabelle 34 (Seite 171) zeigen die dazugehörigen errechneten Standardabweichungen und Signifikanzniveaus (P-Wert, t-Test).

Abbildung 49: Gehalte an aktivem IgY [µg] je mg Probe (TM) nicht past. und past. Livetin- und LDL- Fraktionen, Vergleich CMC 30 und CMC 60 000, CMC-Konzentration: 0,417 %ig, Zentrifugationsbedingungen: 2 800 × g, 8 Min., 5 °C

0

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass nicht past. und past. LDL- und Livetin-Proben, bei einem Vergleich ihrer Gehalte an aktivem IgY, keine signifikanten Unterschiede aufwiesen (Tabelle 33/Tabelle 34). Das hier verwendete Pasteurisationsverfahren besaß keinen Einfluss auf die Aktivität des IgY in der LDL- und Livetin-Fraktion.

Jedoch zeigten die Fraktionen Unterschiede in ihren IgY-Gehalten bei der Verwendung von CMC 30 oder 60 000 (Abbildung 49). In der Livetin-Fraktion (Probe LIVETINE) war unter Verwendung von CMC 60 000 der Gehalt an aktivem IgY um 17,8 % (138,4 µg/mg TM) vermindert, im Vergleich zur Verwendung von CMC 30 (168,3 µg/mg TM) (Tabelle 33).

Gleichermaßen nahm der Gehalt an aktivem IgY in der LDL-Fraktion (Probe LDL) unter Verwendung von CMC 60 000 (9,87 µg/mg TM) um 32,8 % zu, im Vergleich zur Verwendung von CMC 30 (7,43 µg/mg TM) (Tabelle 34). Es konnten, sowohl zwischen der LDL- als auch Livetin-Fraktion, bei einem Vergleich zwischen CMC 30 und CMC 60 000, signifikante Unterschiede der IgY-Gehalte anhand der statistischen Analyse mithilfe des t-Tests festgestellt werden (Tabelle 33/Tabelle 34).

Auch in der past. Livetin-Fraktion (Probe LIVETINE PAST) war unter Verwendung von CMC 60 000 der Gehalt an aktivem IgY um 15,2 % (139,3 µg/mg TM) vermindert, im Vergleich zur Verwendung von CMC 30 (164,2 µg/mg TM). Gleichermaßen nahm der Gehalt an aktivem IgY in der past. LDL-Fraktion (Probe LDL PAST) unter Verwendung von CMC 60 000 um 33,6 % (9,30 µg/mg TM) zu, im Vergleich zur Verwendung von CMC 30 (6,96 µg/mg TM). Hier zeigten sich ebenso anhand der statistischen Analyse signifikante Abweichungen.

Tabelle 33: Gehalte an aktivem IgY [µg] je mg Probe (TM) nicht past. ggt. und past. ggt. Livetin-Fraktionen, Vergleich CMC 30 und CMC 60 000 mit dazugehörigen Standardabweichungen und Signifikanzniveaus (P-Wert), Messwerte siehe Kap. 8.8.4 (Seite 239)

Gehalte an aktivem IgY [µg] je mg Probe (TM)

CMC 30 ^C CMC 60 000 ^D P-Wert

LIVETINE ^A 168,25 ± 5,88 (n=3) 138,41 ± 5,15 (n=3) S ^C/D LIVETINE PAST ^B 164,17 ± 27,20 (n=3) 139,28 ± 11,94 (n=3) S ^C/D

P-Wert NS ^A/B NS ^A/B

Messwerte sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben n: Anzahl gemessener Proben, 25 Eier pro Versuch

P-Wert: gebildet von den Mittelwerten einer Spalte/Zeile, S: signifikant, wenn P ≤ 0,05; NS: nicht signifikant, wenn P > 0,05; S ^C/D: C unterscheidet sich von D signifikant (S), NS ^A/B: A unterscheidet sich von B nicht signifikant (NS)

Tabelle 34: Gehalte an aktivem IgY [µg] je mg Probe (TM) nicht past. ggt. und past. ggt. LDL-Fraktionen, Vergleich CMC 30 und CMC 60 000 mit dazugehörigen Standardabweichungen und Signifikanzniveaus (P-Wert), Messwerte siehe Kap. 8.8.4 (Seite 240)

Messwerte sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben n: Anzahl gemessener Proben, 25 Eier pro Versuch

P-Wert: gebildet von den Mittelwerten einer Spalte/Zeile, S: signifikant, wenn P ≤ 0,05; NS: nicht signifikant, wenn P > 0,05; S ^C/D: C unterscheidet sich von D signifikant (S), NS ^A/B: A unterscheidet sich von B nicht signifikant (NS)

Die hier vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Livetin-Fraktion unter Verwendung des CMC 60 000 pro g Probe um 18 % geringere Gehalte an aktivem IgY aufweist als die Livetin-Fraktion unter Verwendung des CMC 30. Gleichermaßen stieg der IgY-Gehalt der gleichnamigen LDL-Fraktion (CMC 60 000) an, sodass hier vermehrt Teile der Livetin-Fraktion die LDL-Livetin-Fraktion „verunreinigten“, d. h. die Verwendung des CMC 60 000, im Vergleich zur Verwendung des CMC 30, einen geringeren Trennerfolg des Plasmas

Gehalte an aktivem IgY [µg] je mg Probe (TM)

CMC 30 ^C CMC 60 000 ^D P-Wert

LDL ^A 7,43 ± 0,37 (n=3) 9,87 ± 0,67 (n=3) S ^C/D LDL PAST ^B 6,96 ± 0,41 (n=3) 9,30 ± 1,11 (n=3) S ^C/D

P-Wert NS ^A/B NS ^A/B

herbeiführte (Tabelle 33/Tabelle 34). Eine Diskussion über den Einfluss der CMC-Viskosität auf den Trennerfolg des Plasmas findet in Kap. 4.3.4 (Seite 175) statt.

Parallel dazu erfolgte die Bestimmung der IgY-Gehalte in ggt. Eigelb (Probe EIGELB GGT) und past. ggt Eigelb (Probe EIGELB PAST GGT). Diese werden im Folgenden grafisch dargestellt (Abbildung 50).

Abbildung 50: Gehalte an aktivem IgY [µg] je mg Probe (TM) von ggt. Eigelb (Probe EIGELB) und past.

ggt. Eigelb (Probe EIGELB PAST GGT)

Die Tabelle 35 zeigt die dazugehörigen errechneten Standardabweichungen und das Signifikanzniveau (P-Wert). Der Restfeuchtegehalt von EIGELB GGT betrug 3,17 % sowie von EIGELB PAST GGT 3,38 %.

Tabelle 35: Gehalte an aktivem IgY [µg] je mg Probe (TM) von ggt. Eigelb (Probe EIGELB) und past. ggt.

Eigelb (Probe EIGELB PAST GGT) mit dazugehörigen Standardabweichungen und Signifikanzniveaus (P-Wert), Messwerte siehe Kap. 8.8.4 (Seite 240)

aktives IgY EIGELB GGT ^A EIGELB PAST GGT ^B P-Wert

[µg/mg] 21,67 (n=1) 20,05 (n=1) NS ^A/B

Messwerte sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben n: Anzahl gemessener Proben, 25 Eier pro Versuch

P-Wert: gebildet von den Mittelwerten einer Zeile, NS: nicht signifikant, wenn P > 0,05 NS ^A/B: A unterscheidet sich von B nicht signifikant (NS)

0 5 10 15 20 25

EIGELB GGT EIGELB PAST GGT

aktives IgY [µg/mg]

Die IgY-Gehalte nicht past. und past. ggt. Eigelb-Proben wiesen keine signifikanten Unterschiede auf, sodass das hier angewendete Pasteurisationsverfahren (63 °C, 2 Min.) keinen Aktivitätsverlust von IgY hervorrief. JARADAT und MARQUARDT (2000) konnten bei einer Behandlung von 60 °C für 30 Min. ebenfalls keinen Aktivitätsverlust des IgY (ELISA) feststellen.

Gleichermaßen erfolgte eine Bestimmung der IgY-Gehalte in der nicht past. (Probe GRANULA) und past. Granula-Fraktion (Probe GRANULA PAST) (Abbildung 51). Die Tabelle 36 zeigt die dazugehörigen errechneten Standardabweichungen und das Signifikanzniveau (P-Wert). Die Restfeuchten werden im Anhang im Kap. 8.7 (Seite 226) aufgelistet.

Abbildung 51: Gehalte an aktivem IgY [µg] je mg Probe (TM) in der ggt. Granula-Fraktion (Probe GRANULA) und past. ggt. Granula-Fraktion (Probe GRANULA PAST)

Tabelle 36: Gehalte an aktivem IgY [µg] je mg Probe (TM) in der ggt. Granula-Fraktion (Probe GRANULA) und past. ggt. Granula-Fraktion (Probe GRANULA PAST) mit dazugehörigen Standardabweichungen und Signifikanzniveaus (P-Wert), Messwerte siehe Kap. 8.8.4 (Seite 239)

aktives IgY GRANULA ^A GRANULA PAST ^B P-Wert

[µg/mg] 5,72 ± 0,58 (n=3) 4,79 ± 0,96 (n=3) NS ^A/B

Messwerte sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben n: Anzahl gemessener Proben, 25 Eier pro Versuch

P-Wert: gebildet von den Mittelwerten einer Zeile, NS: nicht signifikant, wenn P > 0,05 NS ^A/B: A unterscheidet sich von B nicht signifikant (NS)

0 1 2 3 4 5 6 7

GRANULA GRANULA PAST

aktives IgY [µg/mg ]

Infolge des Pasteurisationsprozesses konnten auch bei der Granula-Fraktion keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Die Gehalte an aktivem IgY in der Granula-Fraktion lagen bei ~ 5,26 µg/mg Probentrockenmasse (gemittelter Wert aus GRANULA und GRANULA PAST).

Anhand der hier durchgeführten Versuche konnte gezeigt werden, dass der größte Teil des aktiven IgY in der Livetin-Fraktion (TM) (CMC 30: 168,2 µg/mg TM) zu finden war, während die Granula-Fraktion die geringste Menge aufwies (5,72 µg/mg TM). In der LDL-Fraktion konnte ein Gehalt von 7,42 µg/mg TM nachgewiesen werden. Bisher war nicht bekannt, wie sich IgY, unter der hier verwendeten Fraktionierungsmethode, in den einzelnen Fraktionen verteilt.

Das IgY stellt, mit einem Anteil von 60-70 %, die Hauptkomponente des γ-Livetins dar (TERNES, 2008a). Es ist seit langem bekannt, dass die Livetin-Fraktion aus α-, β- und γ -Livetinen besteht, wobei der Anteil der γ-Livetine an der Livetin-Fraktion ca. 30 % (WILLIAMS, 1962) betragen (Kap. 3.3.5, Seite 49). Entsprechend dieser Angaben kann berechnet werden, welchen prozentualen Anteil die Livetin-Fraktion an der LDL- oder Granula-Fraktion trägt bzw. diese „verunreinigen“, hier exemplarisch am Beispiel von LDL CMC 30 gezeigt: 7,4 µg aktives IgY sind je mg LDL CMC 30 (TM) enthalten, welches einem Gehalt von ca. 11,4 µg γ-Livetin entspricht und folglich einem Gehalt von 38 µg Livetin-Fraktion (TM) je mg LDL CMC 30 (TM) (3,8 %) (Tabelle 37).

Anhand der errechneten Werte (Tabelle 37) konnte festgestellt werden, dass die Granula-Fraktion, mit einem Anteil < 3 %, die geringste Menge der Livetin-Fraktion beinhaltete. Die LDL-Fraktion ist mit einem Anteil > 3 % (CMC 30) bis 5 % (CMC 60 000) durch die Livetin-Fraktion „verunreinigt“.

Tabelle 37: Anteil der Livetin-Fraktion [%] an der LDL- und Granula-Fraktion (TM), Vergleich CMC 30 und 60 000, berechnet auf der Basis ihrer IgY-Gehalte (Tabelle 34, Tabelle 36)

Anteil der Livetin-Fraktion [%] je mg Probe (TM)

CMC 30 CMC 60 000

LDL 3,8 5,1

LDL PAST 3,6 5,1

GRANULA 2,9

GRANULA PAST 2,5