6. Ergebnisse und Diskussion
me beschränkt. Auch die Arbeiten für das CHORUS–Projekt20, bei dem der Shikimat–Weg in E. coli zur Bereitstellung von Chorismat benutzt wird, können von der erweiterten Ne-benproduktanalytik profitieren, da das Produkt– und vor allem das Nebenproduktspektrum der Produktionsstämme rasch zugänglich sind. Die Messung der extrazellulären Konzentra-tionen konnten wertvolle InformaKonzentra-tionen zur Verbesserung der L-Phe Produzenten beitragen, jedoch lassen sie nur sehr bedingt Rückschlüsse über die intrazellulären Verhältnisse in den Zellen zu. Wenn überhaupt könnten lediglich die zeitlichen Änderungen der extrazellulären Metabolitkonzentrationen, d.h. die Raten, einen Beitrag dafür liefern (Kap. 6.6).
6.4. Identifizierung weiterer Nebenprodukte mit LC–MS
Isolierung HPLC Peak Fraktion
HPLC-MS Messung
Identifizierung potenzieller Molekulargewichte
Suche in ECOCYC Datenbank
Ergebnis ok ? Positive Aufklärung des
unbekannten Metaboliten
Abbildung 6.21.:Prinzipielle Ablaufskizze bei der Identifizierung unbekannter Metabolite in Fermentationsproben
der Strukturaufklärung einer unbekannten Verbindung handelte, wurde der Ionenfallen MS Detektor für die Messungen verwendet. Aufgrund der kompletten Inkompatibilität des Schwefelsäure–Eluenten konnte die organische Säure HPLC nicht direkt an das MS angeschlossen werden. Daher wurden Elutionsvolumina (Fraktionen) der unbekannten Peaks nach dem UV–Detektor manuell aufgefangen und danach als Probe in die HPLC–MS injiziert (Abb. 6.21). Bei der LC–MS wurden zwei Analysen mit unterschiedlichen statio-nären Phasen durchgeführt, ein Lauf mit der Nucleodex–β–OH Phase und einer mit der Hypercarb–Phase23.
Auf der Hypercarb–Phase zeigten Substanzen mit aromatischen oder olefinischen Bin-dungen in aller Regel sehr starke Retention, wogegen auf der Nucleodex–beta–OH Phase in der Regel eine sehr schwache Retention für die meisten kleinen, schwach polaren und auch polaren Verbindungen erzielt werden konnte. Vielleicht konnte so eine zusätzliche chemische Information über die Substanz erhalten werden. Den HPLC–Lauf, aus dem die Peak Fraktion gesammelt wurde, zeigt die Abb. 6.22. Auf der rechten Seite ist die Information des Dioden–Array–Detektors (DAD) mit der Retentionszeit auf der X–Achse und der Wellenlänge auf der Y–Achse gezeigt. Auf der linken Seite ist das UV–Spektrum der unbekannten Substanz dargestellt. Die Retentionszeit der Verbindung ist t = 16,9 min und die UV–Absorptionsmaxima wurden mitλ= 203, 282, 564, 595 nm bestimmt.
In den beiden Probeläufen der LC–MS wurde in den UV–Daten nach dem unbekannten Peak gesucht. In dem Lauf mit der Hypercarb–Phase war kein UV–Peak und kein Peak in den MS–Daten zu erkennen, möglicherweise wurde die Substanz vollständig auf der Säule zurückgehalten. In dem Probenlauf mit der Nucleodex Phase wurden passende UV–Signaturen mit Retentionszeiten von 8–9 min gefunden, wie Abb. 6.23 zeigt. Für die Wegstrecke vom UV– zum MS–Detektor wurden 1,1 min benötigt, daher wurde in den MS–Daten im Zeitfenster von 9–10 Minuten nach potenziellen Massenkandidaten gesucht.
Ein Ausschnitt der gemessenen MS–Daten zeigt Abb. 6.24. Auf der X–Achse ist hier die Retentionszeit und auf der Y–Achse das Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) aufgetragen.
Die Intensität der Massenpeaks in diesem 3D–Plot wird farbig bzw. durch den Grauton ausgewiesen.
23Phase aus sphärischen graphitisierten Kohlenstoffpartikeln
6. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 6.22.:UV–Daten der organischen Säure HPLC mit unbekanntem Peak bei 16,9 min
Abbildung 6.23.:UV–Daten der HPLC–MS Messung der Peak–Fraktion 16,9 min (Nucleodex–β–OH Phase)
6.4. Identifizierung weiterer Nebenprodukte mit LC–MS
Peak16_9_50bis2000_nucleodex RT:6,50 - 15,00 Mass:117 - 384 NL:2,91E5
7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)
150 200
250 300
350
m/z
0 20 40 60 80 100
RelativeAbundance
311
155
253 195
Abbildung 6.24.: MS–Daten der HPLC–MS Messung der Peak–Fraktion 16,9 min (Nucleodex–β–OH Phase)
Die Schwierigkeit bestand nun darin, dass in diesem Zeitfenster nicht nur eine einzige Masse vorhanden war. Daher wurden zunächst alle gefundenen Massen als potenzielle Kandidaten betrachtet und ausgewertet (Tab. 6.8). Der sehr große, deutliche Peak bei m/z = 195 war kein unbekannter Peak, sondern das einfach geladene Dimer–Ion der Schwefelsäure aus der Probelösung. Von den gefundenen Kandidaten passten drei sehr gut in das erwartete Retentionszeitfenster. Auffällig war, dass zwei der Massen eine rechnerische Verbindung zueinander hatten, da m/z = 311 und 155 beide auf die gleiche Molekülmasse von 156 g/mol zurückgeführt werden können, sofern es sich bei ihnen um eine Monomer [M–H]−–Dimer [2M–H]− Kombination handelt. Solche Monomer–Dimer Dubletten wurden auch für andere Substanzen in dieser Arbeit beobachtet und lassen darauf schließen, dass es sich bei diesen beiden Peaks mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht um Artefakte handelte.
Neben der m/z = 155 und 311 wurde eine Masse von m/z = 253 im passenden Zeitfenster identifiziert und mit den zugehörigen potenziellen Molekularmassen von 156 und 254 g/mol Suchläufe gegen die ECOCYC Datenbank durchgeführt. Die erhaltenen Treffer sind in Tab. 6.8 dargestellt. Lediglich bei 4 Substanzen war eine korrekte Massenübereinstimmung gefunden worden, wobei 2–Phosphoglycolat und Shikimat–3–phosphat überhaupt nicht mit dem UV–Spektrum der gesuchten Substanz übereinstimmen konnten. Es blieben nur 2,3–Dihydro–2,3–dihydroxybenzoat und Orot–Säure als potenzielle Treffer übrig. Beide Verbindungen waren kommerziell erhältlich, und über eine Referenz–Messung konnte Orotsäure eindeutig als Substanz unter dem Peak 16,9 min in der organischen Säure HPLC identifiziert werden.
Mit dem gleichen methodischen Vorgehen (Abb. 6.21) wurde ein weiterer unbekannter Peak mit einer Retentionszeit von 25 min untersucht. Durch die Verwendung der UV–Daten
6. Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 6.8.: Datenbank–Abfrage ECOCYC für den Molekulargewichtsbereich 153–159 (Nr. 1–8) und 251–257 g/mol (Nr. 9–13); Treffer mit korrekter Molmasse hervorgehoben
Treffer Nr. Name Molekülmasse
1 3–Sulfinoalanine 153,15
2 2,3–Dihydroxybenzoate 154,12
3 L–Histidin 155,16
4 2–Phosphoglycolate 156,03
5 Orotsäure 156,10
6 2,3–Dihydro–2,3–dihydroxybenzoat 156,14
7 Allantoin 158,12
8 Dihydroorotsäure 158,11
9 5’–Deoxyadenosine 251,24
10 Deoxyadenosine 251,24
11 Deoxyinosine 252,23
12 Shikimate–3–phosphate 254,13
13 Dihydro–neo–pterin 255,23
wurde der Peak in einem LC–MS Lauf ermittelt, anhand der MS–Daten das Molekular-gewicht bestimmt und durch die ECOCYC Datenbank als Uracil identifiziert. Über die Referenzmessung mit einem kommerziellen Standard konnte das verifiziert werden. Die ermittelten maximalen Konzentrationen der beiden Substanzen in Fermentationen mit L-Phe Produzenten liegen im Bereich von 0,6–1g L−1(Uracil) und 0,2–0,8 g L−1(Orotsäure).
Damit lagen sie auf dem erwartet niedrigen Niveau, auf dem sie in der Metabolit–Bilanz nicht signifikant ins Gewicht fallen und auch von der in dieser Arbeit verwendeten 1H–
NMR–Methode nicht erfasst werden konnten.
Beide Substanzen waren in der Literatur bereits als fermentative Nebenprodukte von E. coli beschrieben worden [187], wobei es jedoch vom verwendetenE. coli Stamm abhängig war, welches der beiden beobachtet wurde. Während der Phase exponentiellen Wachstums wurde im Medium einiger E. coli K12 Stämme Orotsäure und in anderen K12 Stämmen, sowie den E. coli B Stämmen Uracil als Nebenprodukt in Konzentrationen von < 1 g L−1beschrieben. Ein Literaturhinweis auf die Ursache der Uracil Bildung als Nebenpro-dukt konnte bisher nicht gefunden werden, für die Bildung von Orotsäure anstatt Uracil in einigen K12 Stämmen wird ein Gen–Defekt der Oritidin–5–phosphate Decarboxylase, einem Enzym in der Pyrimidin–Biosynthese, vermutet [187].
Im Unterschied zur Literatur wurde in vielen der hier verwendetenE. coli Stämmen sowohl Uracil als auch Orotsäure als Nebenprodukt beobachtet, unabhängig ob es sich um einen L–
Phe Produzenten oder Metabolit–Produzenten handelte (Kap. 4.1.1). Die Orotsäurebildung war dabei hauptsächlich an das Wachstum gekoppelt, während die Uracilbildung erst nach IPTG Induktion der plasmid–codierten Gene begann und die zuvor gebildete Orotsäure im selben Zeitraum teilweise wieder abnahm. Möglicherweise ist hierfür nicht nur ein genetischer Defekt verantwortlich, sondern ein Mechanismus der metabolischen Regulation in der Zelle.