4 Ergebnisse
4.5 Identifizierung erkannter CD4 + T-‐‑Zell-‐‑Epitope
102
Abb. 4.24. Schematische Darstellung der Methode zur direkten Identifizierung von CD4-‐‑T-‐‑Zell-‐‑Epitopen. Anti-‐‑
gen-‐‑kodierende DNA wird mittels häufig schneidender Restriktionsenzyme verdaut. Daraus resultierende DNA-‐‑
Fragmente (Länge ~60-‐‑120 Basenpaare) werden in einen, für Bakterien geeigneten Expressionsvektor ligiert. In einer 96-‐‑Loch-‐‑Kulturplatte wird aus Vektorgemisch-‐‑transformierten E.coli-‐‑Bakterien eine Bibliothek, bestehend aus zufäl-‐‑
ligen Bakterien-‐‑Pools, erstellt. Durch IPTG (Isopropyl-‐‑β-‐‑D-‐‑thiogalactopyranosid)-‐‑Zugabe wird die bakterielle Pro-‐‑
tein-‐‑Expression induziert. Bakterien, die nach Transformation die Fähigkeit zur Produktion eines Antigen-‐‑Fragment-‐‑
CAT (Chloramphenicol-‐‑Acetyltransferase)-‐‑Fusionsproteins besitzen, werden mithilfe von Chloramphenicol selek-‐‑
tiert. Eine Suspension dieser Bakterien-‐‑Pools wird nachfolgend direkt mit APZ kokultiviert. 24 h nach Beginn der Kokultur werden CD4+ T-‐‑Lymphozyten zugesetzt. Nach weiterer 16-‐‑stündiger Kulturphase wird die IFN-‐‑γ-‐‑
Konzentration mittels Standard-‐‑ELISA gemessen. Positiv-‐‑getestete Bakterien-‐‑Pools werden aus der Bibliothek heraus auf Kultur-‐‑Agar-‐‑Platten ausplattiert. Einzelkolonien dieser Bakterien-‐‑Pools werden daraufhin erneut, wie oben be-‐‑
schrieben, in der T-‐‑Zell-‐‑Kokultur getestet. Erkannte Antigen-‐‑Fragment-‐‑Sequenzen können abschließend durch DNA-‐‑
Sequenz-‐‑Analyse identifiziert werden. (Abbildung abgeändert nach Milosevic et al., 2006).
DNS-‐‑Fragmente mit variabler Sequenzlänge. Im Idealfall decken diese DNS-‐‑Fragmente die Sequenz der ursprünglich eingesetzte Antigen-‐‑DNS mehrfach ab. Durch nachfol-‐‑
gende Ligation in den Expressionsvektor werden die DNS-‐‑Fragmente mit der 3’ strang-‐‑
abwärts gelegenen Sequenz der Chloramphenicol-‐‑Acetyltransferase (CAT) fusioniert.
Nach späterer Transformation der Ligationsprodukte ermöglicht dies die Selektion er-‐‑
folgreich eingefügter DNS-‐‑Fragmente. Transformierte Bakterien exprimieren die Fusi-‐‑
104 onsproteine und überleben demnach unter Einsatz geeigneter Antibiotika nur solange es zu einer Expression der gesamten Antigenfragment-‐‑CAT-‐‑Sequenz kommt. Liegen die Antigenfragmente nicht im Leserahmen der ursprünglichen Antigensequenz ent-‐‑
steht statistisch gesehen alle 64 Basen ein Stop-‐‑Codon. Bei ausreichender Länge der ein-‐‑
gefügten DNS-‐‑Fragmente reduziert dies automatisch die Zahl unbrauchbarer Ligati-‐‑
onsprodukte. Erfolgreich transformierte Bakterien werden als Bakterien-‐‑Mischungen (Pools) mit zufälliger Fragment-‐‑Zusammensetzung kultiviert und nachfolgend mit ge-‐‑
eigneten APZ kokultiviert. Die eingesetzten APZ nehmen die Bakterien selbständig aus dem Kulturmedium auf und präsentieren die beinhalteten Peptidfragmente physiolo-‐‑
gisch im Kontext von MHC-‐‑Klasse-‐‑II-‐‑Molekülen. Die Komplexität der einzelnen Pools sollte so gewählt werden, dass die Länge der ursprünglichen Antigensequenz durch die in der Gesamtheit der Pools vorliegenden DNS-‐‑Fragmente mehrfach abgedeckt wird.
Somit sollte es nach Kokultivierung Bakterien-‐‑beladener APZ mit Antigen-‐‑spezifischen CD4+ T-‐‑Lymphozyten zur Erkennung einer oder mehrerer Bakterien-‐‑Mischungen kommen. Erkannte Bakterien-‐‑Pools können aus der Ursprungskultur heraus ausplat-‐‑
tiert werden und im Folgenden als Einzelkolonien auf APZ geladen werden. Nach er-‐‑
neuter APZ-‐‑T-‐‑Zell-‐‑Kokultur können wiederum erkannte Bakterienkolonien der Plas-‐‑
mid-‐‑Präparation zugeführt werden und die Nukleotidsequenz der vorliegenden DNS-‐‑
Fragmente sequenziert werden.
Die DEPI-‐‑Methode stellt somit einen einfachen und schnell durchzuführenden Arbeits-‐‑
ablauf zur Identifizierung von MHC-‐‑Klasse-‐‑II-‐‑Epitopen dar.
4.5.2 Test isolierter TAA-‐‑spezifischer CD4+ T-‐‑Zell-‐‑Klone
Wie in Abschnitt 3.6 beschrieben wurde eine DEPI-‐‑Expressionsbibliothek unter Einbe-‐‑
zug der fünf zur De-‐‑novo-‐‑Induktion TAA-‐‑spezifischer CD4+ T-‐‑Zellen genutzten C/T-‐‑
Antigene erstellt. Um auch die Erkennung möglicher generierter Neo-‐‑Epitope abzude-‐‑
cken beinhalteten die in die Restriktion eingesetzten DNS-‐‑Sequenzen jeweils das flan-‐‑
kierende CrossTAg-‐‑Sortierungssignal. Die durchschnittliche Länge der eingefügten DNS-‐‑Fragmente betrug 82 Nukleotide. Nach Transformation konnte anhand des Probe-‐‑
ausstrichs eine Gesamtzahl von 180 Kolonie-‐‑formenden Bakterien errechnet werden.
Die somit in Bakterien vorliegenden DNS-‐‑Fragmente deckten die Gesamtlänge aller eingesetzten Antigensequenzen von 4,2 Kilobasen in etwa dreifach ab. Die Gesamtzahl von 180 Kolonien wurde nachfolgend auf insgesamt 40 Loch einer 96-‐‑Loch-‐‑Kulturplatte verteilt. Die Komplexität einer Plattenvertiefung belief sich demnach auf vier bis fünf unterschiedliche
DNS-‐‑Fragment-‐‑tragende
Bakterienkolonien.
Zur
Untersuchung
der
Abb. 4.25. Versuchsansatz zur direkten Epitop-‐‑Identifizierung unterschiedlicher CD4+ T-‐‑Zell-‐‑Klone. Zufällige Mischungen Antigenfragment-‐‑tragender E. coli-‐‑Bakterien (Stamm XL-‐‑1 Blue) wurden, durch Zugabe ins Kulturmedium, 16 Stunden mit mLCL-‐‑Zellen koinkubiert. Die zuvor generierte Bakterien-‐‑Ex-‐‑
pressions-‐‑Bibliothek deckt die Sequenzen aller fünf Stimulati-‐‑
onsantigene (GAGE-‐‑1-‐‑CrossTAg, MAGE-‐‑A4-‐‑CrossTAg, NY-‐‑
ESO1-‐‑CrossTAg, SSX4-‐‑CrossTAg, XAGE-‐‑1-‐‑CrossTAg) statistisch mehrfach ab (~ 3x). Bakterien-‐‑beladene mLCL wurden nachfol-‐‑
gend in die Kokultur mit autologen CD4+ T-‐‑Zell-‐‑Klonen (GAGE-‐‑
1-‐‑TZR-‐‑1/-‐‑2/-‐‑3, MAGE-‐‑A4-‐‑TZR-‐‑1, SSX4-‐‑TZR-‐‑1 und XAG E-‐‑1-‐‑
TZR-‐‑1/-‐‑2) eingebracht. Im Balken-‐‑Diagramm dargestellt ist die IFN-‐‑γ-‐‑Konzentration im Kulturüberstand 16 h nach Ansatz der Kokultur (Einzelwerte). Die IFN-‐‑γ-‐‑Konzentration wurde mittels Standard-‐‑ELISA (Absorptionsmessung bei 450 nm, Wellenlän-‐‑
genkorrektur bei 570 nm) gemessen.
106 CD4+ T-‐‑Zell-‐‑Erkennung wurden die Kulturen des DEPI-‐‑Ansatzes über zwei Inkubati-‐‑
onsrunden im Brutschrank expandiert und durch Zugabe ins Kulturmedium über Nacht mit mLCL des autologen Blutspenders koinkubiert. Nach erfolgter Epitop-‐‑Bela-‐‑
dung der APZ wurden diese in die Kokultur mit Referenzklonen aller isolierter C/T-‐‑
Antigen-‐‑spezifischer CD4+ T-‐‑Lymphozyten eingesetzt (siehe Abb. 4.25).
In Bezug auf ihre IFN-‐‑γ-‐‑Sekretion zeigten alle T-‐‑Zell-‐‑Klone mit unterschiedlicher Anti-‐‑
genspezifität ein jeweils einmaliges Reaktionsmuster. CD4+ T-‐‑Zell-‐‑Klone mit gleicher Antigenspezifität bestätigten jedoch das Reaktionsmuster des jeweils anderen Klons. So konnte übereinstimmend für T-‐‑Zell-‐‑Klone mit Rezeptor GAGE-‐‑1-‐‑TZR-‐‑1 und -‐‑2 eine spezifische IFN-‐‑γ-‐‑Freisetzung nach Kokultur mit Bakterien-‐‑beladenen APZ der Pools 2-‐‑
C und 4-‐‑F detektiert werden. GAGE-‐‑1-‐‑TZR-‐‑2-‐‑Zellen erkannten zudem Bakterien-‐‑bela-‐‑
dene APZ des Pools 5-‐‑A. Für CD4+ T-‐‑Lymphozyten mit MAGE-‐‑A4-‐‑TZR-‐‑1 hingegen konnte eine IFN-‐‑γ-‐‑Sekretion ausschließlich in Kokultur mit APZ der Pools 1-‐‑E, 4-‐‑H und 5-‐‑D nachgewiesen werden. In Kokultur mit C/T-‐‑Antigen-‐‑spezifischen T-‐‑Zellen mit Re-‐‑
zeptor XAGE-‐‑1-‐‑TZR-‐‑1 führten indes nur Bakterien-‐‑beladene APZ der Pools 1-‐‑F, 4-‐‑F und 5-‐‑C zu einer spezifischen Erkennung. XAGE-‐‑1-‐‑TZR-‐‑2-‐‑Zellen zeigten im Gegensatz zu den oben beschriebenen T-‐‑Zell-‐‑Klonen kein deutlich abgesetztes Reaktionsmuster, be-‐‑
stätigten jedoch mit geringfügig erhöhter IFN-‐‑γ-‐‑Sekretion nach Kokultur mit APZ der Pools 1-‐‑F, 4-‐‑F und 5-‐‑C das Reaktionsmuster der XAGE-‐‑1-‐‑TZR-‐‑1-‐‑Zellen. CD4+ T-‐‑Zellen mit XAGE-‐‑1-‐‑TZR-‐‑2 zeigten zudem eine schwache Erkennung des Pools 3-‐‑F.
Alle spezifisch erkannten Bakterien-‐‑Pools müssten im nächsten Schritt demnach auf ge-‐‑
eigneten Agarplatten ausgestrichen werden und somit erhaltene Einzelkolonien erneut in die APZ Kokultur eingesetzt werden. Nach wiederholter T-‐‑Zell-‐‑APZ-‐‑Kokultur sollte die Sequenzierung isolierter Plasmid-‐‑DNS Aufschluss über die jeweils erkannten Epitope geben. Diese nachfolgenden Schritte konnten jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter verfolgt werden.
Die Versuchsansätze für T-‐‑Zell-‐‑Klone mit Rezeptor GAGE-‐‑1-‐‑TZR-‐‑3 und SSX4-‐‑TZR-‐‑1 müssten zudem wiederholt werden, da in diesen Fällen keine spezifische IFN-‐‑γ-‐‑Frei-‐‑
setzung detektiert werden konnte. Dies könnte auf eine fehlerhafte Beladung der APZ zurückzuführen sein. Da jedoch für alle getesteten CD4+ T-‐‑Zell-‐‑Klone eine effiziente IFN-‐‑γ-‐‑Sekretion in Kokultur mit Antigen-‐‑CrossTAg-‐‑ivt-‐‑mRNS-‐‑transfizierten APZ nach-‐‑
zuweisen war, kann weiterhin nicht ausgeschlossen werden, dass die hier erstellte Ex-‐‑
pressionsbibliothek die benötigten DNS-‐‑Fragmente wider Erwarten nicht beinhaltete.
In diesem Fall müsste für die erfolgreiche Epitop-‐‑Identifizierung eine neue bakterielle Expressionsbibliothek erstellt werden.